[发明专利]一种抗塞尼卡谷病毒VHH抗体的酵母cDNA文库及其构建方法和用途

摘要

本发明公开了一种抗塞尼卡谷病毒VHH抗体的酵母cDNA文库及其构建方法和用途，本发明从塞尼卡谷病毒灭活疫苗免疫的骆驼外周血中分离得到淋巴细胞，通过RT‑PCR的方法得到抗塞尼卡谷病毒VHH抗体的cDNA片段，将VHH抗体的cDNA片段与pGADT7‑Rec共转化酵母感受态细胞，得到抗塞尼卡谷病毒VHH抗体的酵母cDNA文库。结果表明该文库的滴度约为7.2×106cfu/ml，文库的重组率为100％。进一步对文库进行初步功能性鉴定，表明所构建的酵母文库中存在具有抗塞尼卡谷病毒的VHH抗体。本发明的提出为筛选抗塞尼卡谷病毒VHH抗体提供了平台，并且为塞尼卡谷的早期治疗和诊断提供了新的方法。

主权项

1.一种抗塞尼卡谷病毒VHH抗体的酵母cDNA文库的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤(1)、淋巴细胞分离：从塞尼卡谷病毒灭活疫苗免疫的骆驼的抗凝血中分离得到淋巴细胞，保存备用；步骤(2)、淋巴细胞总mRNA的提取：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；步骤(3)、全基因cDNA合成：以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；步骤(4)、第一轮扩增：以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1为引物进行第一轮扩增，将扩增产物电泳，纯化收集600bp产物，备用；SEQ ID NO.1‑P1:5‑GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG‑3SEQ ID NO.2‑R1:5‑GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC‑3步骤(5)、第二轮扩增：以第一轮扩增产物为模板，以P2、R2为引物进行第一轮扩增，扩增产物电泳，纯化收集400bp产物，备用；SEQ ID NO.3‑P2:5‑TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCTGGGGGAGG‑3SEQ ID NO.4‑R2:5‑GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGGT‑3步骤(6)、文库的构建和收获：将第二轮扩增产物和pGADT7‑Rec载体转化酵母感受态细胞，30℃倒置培养直至克隆出现，之后收集菌液，即得抗塞尼卡谷病毒的VHH抗体酵母cDNA文库。