[发明专利]一种过表达COX5A转基因鼠模型及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种过表达COX5A转基因鼠模型及其构建方法与应用，包括以下步骤：PCR克隆扩增目的基因COX5A的开放读码框；构建pcDN A3.1(+)‑m‑COX5A质粒；将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取，并回收DNA片断；纯化DNA，对DNA进行溶解回收；用TE显微注射稀释液稀释DNA样品；将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；PCR法鉴定阳性转基因鼠；筛选出COX5A表达水平最高的品系，建立稳定的COX5A过表达小鼠模型。本发明首次获得过表达COX5A转基因鼠模型，为制备预防或者治疗脑老化、老化相关疾病药物提供了新的策略。

主权项

1.一种过表达COX5A转基因鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、PCR克隆扩增目的基因COX5A(GeneID:12858)的开放读码框，目的片段386bp；步骤2、pcDNA3.1(+)‑m‑COX5A质粒构建：经过酶切、DNA片段回收、连接反应用内切酶EcoRI与XhoI酶切pcDNA3.1(+/‑)Vector载体和插入的目的片段COX5A的ORF；步骤3、将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取，通过大量制备质粒DNA，电泳、用QiagenDNA凝胶回收试剂盒回收DNA片断；步骤4、用SephedexG50的凝胶柱纯化DNA，用TE溶液对DNA进行溶解回收；步骤5、回收片断，用于显微注射，用0.22μm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释DNA样品，12000g，离心2小时，上清液的2/3进行分装；步骤6、将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；步骤7、PCR法鉴定阳性转基因鼠，转基因小鼠在出生9‑14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，利用特异引物通过PCR法进行检测；PCR鉴定阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；获得表达386bp目的片段的COX5A过表达转基因小鼠；步骤8、运用RT‑PCR及Western blot技术筛选出COX5A表达水平最高的品系，建立稳定的COX5A过表达小鼠模型；首建鼠合笼后得到数只F0代鼠，为排除不同插入位点对PDGF‑BB表达的影响，运用RT‑PCR及WB技术对F0代鼠产下的子代进行COX5A的基因和蛋白表达检测，筛选出最高表达的品系，留种繁殖；获得COX5A过表达转基因F0代鼠。