[发明专利]一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法

摘要

本发明公开了一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法，涉及生物化学与分子生物学领域，步骤为：AGPase亚基蛋白Sh2和Bt2抗体的制备，AGPase亚基Sh2和Bt2抗体的特异性验证，授粉后15天、20天和27天玉米胚乳蛋白的提取，授粉后15天、20天和27天玉米胚乳磷酸化蛋白的富集，授粉后15天、20天和27天玉米籽粒磷酸化蛋白的检测和验证；本发明在制备好抗体后，结合Phos‑tag技术具有快速确定AGPase酶是否发生磷酸化的优势，并且不需要进行质谱，因而成本低。并且此方法只要有特异的相应蛋白抗体，具有推广到鉴定任意一种蛋白磷酸化的鉴定上，因此具有蛋白质磷酸化鉴定的广泛应用。

主权项

1.一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：(1)通过基因克隆、原核表达载体构建、蛋白诱导表达和纯化及动物的免疫和血清的分离制备AGPase亚基蛋白Sh2和Bt2抗体；(2)采用Western blot检测AGPase亚基Sh2和Bt2抗体的特异性；(3)取材玉米高淀粉自交系08‑641授粉后15天、20天和27天的玉米籽粒胚乳，在液氮中研磨至粉末，称重；以1g/3mL的比例加入相应的裂解液，并加入蛋白酶抑制剂，混匀，放置冰上30min；在4℃下12000rpm离心15min，吸取上清于新的离心管，12000rpm离心5min，吸取上清；在3mL反应液中加入6μL的上清，测OD595值，计算蛋白浓度；(4)取上步获得的蛋白，利用Phos‑tag小磁珠富集结合磷酸化蛋白，经过杂蛋白洗涤，洗脱磷酸化蛋白；(5)利用制备的AGPase酶大小亚基抗体，将洗脱的磷酸化蛋白SDS‑PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，大小亚基一抗杂交，曝光检测是否有条带判断AGPase酶大小亚基是否发生磷酸化；再取玉米胚乳裂解总蛋白10μg，加碱性磷酸酶4μL和2μL 10×碱性磷酸酶buffer，加蛋白裂解液将总体积调为20μL,37℃下反应3h，电泳后转膜，牛奶封闭，Western blot杂交，验证Sh2和Bt2是否去磷酸化，从而证明是否发生磷酸化。