[发明专利]一种培育果枝夹角改变的转基因棉花的方法

摘要

本发明棉花育种技术领域，公开了一种培育果枝夹角改变的转基因棉花的方法，包括制备胚性愈伤组织，制备含有目的基因的重组农杆菌，制备农杆菌菌悬液，共培养转化，选择培养，分化培养等步骤，采用特殊的苗培养基配方、愈伤组织培养基、胚性愈伤组织培养基、共培养液配方，简化了种子处理步骤，减少愈伤组织染菌率，提高了基因转化效率。

主权项

1.一种培育果枝夹角改变的转基因棉花的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，制备胚性愈伤组织：取棉花种子，无菌水清洗，沥干水分，然后将棉花种子浸泡于苗培养基中，20-28℃暗培养3-4d，接着20-28℃光培养2-3d，得到幼苗；将幼苗的下胚轴切成茎段，平铺到愈伤组织培养基中进行诱导培养，3-4周继代一次，然后选取松散的愈伤组织接种在胚性愈伤组织诱导培养基上培养，诱导胚性愈伤组织的产生；其中每升苗培养基的制备方法如下：在1L MS培养基中加入20-50mg抗菌剂，混匀；每升愈伤组织培养基的制备方法如下：在1L MS培养基中加入20-50mg维生素B5，混匀；每升胚性愈伤组织培养基的制备方法如下：在1L YP培养基中加入20-50mg维生素B5和10-20mg抗菌剂，混匀；S2，制备含有目的基因的重组农杆菌：将含有目的基因的重组质粒转入农杆菌细胞中，得到重组农杆菌；其中重组农杆菌含有Kan基因；S3，制备农杆菌菌悬液：将重组农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD600＝0.4-0.6，培养温度为28±1℃，得到农杆菌菌液，离心，收集的菌体经营养液重悬，得到农杆菌菌悬液，备用；每升营养液的制备方法如下：在1L MS培养基中加入10-20mg卡那霉素，混匀；S4，共培养转化：将胚性愈伤组织浸泡于农杆菌菌悬液中，浸染5-10min，取出胚性愈伤组织，吸干胚性愈伤组织表面残留的菌悬液，然后将胚性愈伤组织平铺至覆有一层滤纸的共培养液上，28±1℃暗室培养24-48h，得到共培养转化的胚性愈伤组织；每升共培养液的制备方法如下：在1L MS培养基中加入1μL 0.1mol/L氯化钙溶液和100μL 1mmol/L氯化钠溶液，混匀；S5，选择培养：将共培养转化的胚性愈伤组织取出，用无菌水漂洗，吸干水分，然后转接到选择培养基上，25±1℃，光周期培养45-60d，其中每15-20d继代一次，每次继代时选择新长出的胚性愈伤组织；每升选择培养基的制备方法如下：在1L MS培养基中加入30-50mg卡那霉素，混匀；S6，分化培养：最后一次选择的胚性愈伤组织置于分化培养基中分化培养，直至分化出苗，得到转基因苗，然后对转基因苗进行基因鉴定，筛选出阳性苗，完成转基因植株的构建。