[发明专利]一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法

摘要

本发明提供一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，包括如下步骤：1)构建重组病毒质粒pTRV2‑RhPDS；2)制备侵染液；3)使用高压喷枪法和真空渗透法分别侵染月季植株、月季扦插苗和已经生根月季组培苗，后续并检测基因沉默效率；4)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。本发明的有益效果是：提高了VIGS技术体系在月季中的应用效率，为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。

主权项

1.一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)构建重组病毒质粒pTRV2‑RhPDS；

2)利用所述重组质粒pTRV2‑RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101，含有pTRV1和pTRV2‑RhPDS的农杆菌GV3101菌液，按照1:1混合，制备侵染液；

3)将所述侵染液避光室温静置活化4小时后分别使用高压喷枪法侵染4片复叶的月季植株、使用真空渗透法侵染2片复叶的扦插苗和生根组培苗；

4)将所述步骤3)中侵染后的月季植株和扦插苗经暗处理24小时之后置于常规栽培基质，在植物培养室分别培养60天和30天，将所述步骤3)中侵染后的生根组培苗栽种到生根培养基中进行无菌培养30天；

5)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面对所述步骤4)中培养后的月季植株、扦插苗和组培苗进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。

2.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：步骤1)中构建重组质粒pTRV2‑RhPDS的方法为：

步骤一，提取月季的总RNA并进行反转录,得到cDNA；

步骤二，用酶切引物对所述cDNA进行PCR扩增,得到RhPDS基因386bp片段；

步骤三，对所述PCR扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，采用连接酶进行过夜连接，重组质粒转化入大肠杆菌中扩繁，然后提取重组质粒，进行双酶切验证。

3.根据权利要求2所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤二中所述PCR扩增时的引物1的核苷酸序列为序列表中序列2，所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列3。

4.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤2)中制备侵染液的过程为：将分别含有pTRV1、pTRV2、pTRV2‑RhPDS的农杆菌GV3101菌液在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上培养36‑48小时，挑取各自单菌落，于5ml含有相同种类和浓度的LB液体培养基培养24小时，转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、200μM AS、10mM MES的200ml LB培养基中培养过夜；当菌液的OD600约为0.8时，4000rpm离心10分钟，用含有200μM AS、10mM MES、10mM MgCl2的悬菌液分别收集菌液,调节各个菌液OD600均为1.0，将含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2的农杆菌GV3101菌液、含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2‑RhPDS的农杆菌GV3101菌液按照1:1混合，避光室温静置活化4小时后，侵染液制备完成。

5.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤3)中所述高压喷枪法的方法为：对4片复叶时期的月季植株叶片的正面和背面喷射，直到有菌液渗透为止，随后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成；所述高压喷枪法侵染的压力为75psi。

6.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤3)中的真空渗透法的方法为：在真空泵中，将2片复叶时期的月季扦插苗和已经生根月季组培苗浸没在侵染液中，真空状态下反复抽吸两次，每次一分钟，最后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成。

7.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤5)中RhPDS基因的相对表达量采用qRT‑PCR方法进行分析，步骤如下：选取pTRV2‑RhPDS侵染过的植株提取总RNA，并反转录为cDNA，在RhPDS基因沉默片段以外设计得到引物3、引物4，以18S为内参基因扩增内参基因引物为引物5、引物6，采用qRT‑PCR分析检测，得到RhPDS基因的相对表达量。

8.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤4)中的生根培养基包括50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢霉素、1/2MS、0.05mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。

9.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法得出的优化方案，其特征在于：采用月季组培苗通过真空渗透法侵染。