[发明专利]采用单链核苷酸片段体外修复HBA2基因突变的方法

摘要

本发明公开了一种采用单链核苷酸片段体外修复HBA2基因突变的方法，包括以下步骤：根据HBA2基因突变位点上下游的序列设计sgRNA和ssODN；sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，ssODN的序列如SEQ.ID.NO.2所示；构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，提取质粒并沉淀浓缩；通过电转仪将上述质粒和ssODN转入患者iPS细胞；利用流式仪分选EGFP荧光阳性克隆并接种细胞；测序鉴定单克隆，获得打靶修复成功的细胞系。CRISPR/Cas9在基因定点修饰方面应用广泛，且制作简单、作用高效。另外，利用长度为100bp的单链核苷酸片段合成简易，而且能成功实现同源重组。

主权项

1.一种体外修复HBA2基因突变的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据HBA2基因突变位点上下游的序列设计sgRNA和单链核苷酸片段；

所述sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述单链核苷酸片段的序列如SEQ.ID.NO.2所示；

(2)构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，提取质粒并沉淀浓缩；

(3)通过电转仪将上述质粒和ssODN转入患者iPS细胞；

(4)利用流式仪分选EGFP荧光阳性细胞并将其接种；

(5)测序鉴定单克隆，获得打靶修复成功的细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，是将sgRNA与其反向互补序列退火，与已经过Bbs I线性化的PX458质粒进行连接。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(3)是：在生长密度为70‑80％的患者iPS细胞中提前加入抗凋亡因子，然后消化细胞并收集，离心后再重复洗涤一遍；将混匀好的质粒、ssODN及电转液对细胞沉淀进行充分重悬，使其处于单细胞均匀状态后利用电转仪进行电击；再将细胞种于已经被基质胶处理过的培养皿中，加入抗凋亡因子继续培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的抗凋亡因子是Y‑27632。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)是：将电转48h后的细胞消化成单细胞，通过流式分选仪将EGFP阳性细胞分选出来，随后将细胞以低密度种于已经被基质胶处理过的培养皿中，使其之后长成单克隆。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的低密度是指600个细胞/cm²。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(5)是：在流式分选十余天后，单克隆细胞团长得足够大，挑取每个克隆团块的部分细胞，以其为模板进行PCR，将得到的PCR产物进行测序，突变位点C恢复成T的克隆则为阳性细胞系，表示成功体外修复HBA2基因突变。