[发明专利]一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白相互作用中的应用有效
| 申请号： | 201711193064.8 | 申请日： | 2017-11-24 |
| 公开（公告）号： | CN108048480B | 公开（公告）日： | 2021-04-23 |
| 发明（设计）人： | 易犁;王婷;张桂敏;梅萌;王钦宏 | 申请（专利权）人： | 湖北大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/62;G01N33/68 |
| 代理公司： | 北京轻创知识产权代理有限公司 11212 | 代理人： | 杨立;陈璐 |
| 地址： | 430062 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种基于酿酒酵母的split‑TEV‑Fast系统方法及其在检测蛋白互作中的应用，包括：1)构建载体pESD‑PPI，其含受半乳糖诱导的一个正向启动子和一个双向启动子，所述正向启动子用以表达TEV‑Fast蛋白酶底物与FLAG和HA标签序列，所述双向启动子用以表达拆分的TEV‑Fast蛋白酶和待测目的蛋白；2)用半乳糖同时诱导启动子，引发下游基因等量表达；3)利用分别识别FLAG和HA标签序列的荧光抗体对细胞进行标记；4)利用流式细胞仪检测细胞表面荧光信号，根据单双荧光信号判断蛋白之间相互作用的强度。本发明在TEV‑Fast蛋白酶及其底物‑COOH端使用不同强度的内质网滞留信号肽，可扩大检测蛋白互作的范围，并根据最终检测的单双荧光信号强度的比例分析蛋白互作的强弱。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 split tev fast 系统 构建 方法 及其 检测 蛋白 相互作用 中的 应用 | ||
【主权项】：
1.一种split-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建载体pESD-PPI，所述载体pESD-PPI包含均受同一诱导剂诱导的一个正向启动子和一个双向启动子，所述正向启动子用以表达TEV-Fast蛋白酶的底物多肽和标签序列的对应的多肽，所述双向启动子用以表达拆分的TEV-Fast蛋白酶和待测的目的蛋白；(2)采用诱导剂诱导启动子，引发下游基因同时进行等量表达；(3)利用FLAG标签的荧光抗体和HA标签的荧光抗体对细胞进行荧光标记；(4)利用流式细胞仪检测细胞表面展示的单双荧光信号，再根据单双荧光信号的比例来判断蛋白与蛋白之间的相互作用的强度。
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