[发明专利]一种测试烟草制品诱导血管内皮细胞凋亡的方法

摘要

一种测试烟草制品诱导血管内皮细胞凋亡的方法，其特征在于通过制备烟草制品溶液，离心和滤膜纯化后，对接种了合适密度的并进行过夜培养的人血管内皮细胞进行染毒暴露，再通过消化细胞制备细胞悬液进行Annexin V‑FITC和PI的染色，最后用流式细胞仪对细胞检测从而快速分析细胞凋亡的情况。该方法具有操作简便、灵敏度高、结果可靠等优点，能够准确检测不同类型烟草制品对于人血管内皮细胞凋亡的诱导情况。

主权项

一种测试烟草制品诱导血管内皮细胞凋亡的方法，其特征在于：通过制备烟草制品溶液，离心和滤膜纯化后，对接种了合适密度的并进行过夜培养的人血管内皮细胞进行染毒暴露，再通过消化细胞制备细胞悬液进行Annexin V‑FITC和PI的染色，最后用流式细胞仪对细胞检测从而快速分析细胞凋亡的情况；该方法具体步骤如下：1）制备烟草制品溶液：a)制备卷烟或电子烟烟气总粒相物溶液：将卷烟或电子烟样品使用吸烟机抽吸，使用剑桥滤片捕集主流烟气总粒相物，DMSO萃取捕集在剑桥滤片上的烟气粒相物组分，滤器过滤后于‑80 ℃保存待用；b)制备袋装型口含烟溶液：将口含烟内容物用去离子水和 DMSO溶解成溶液；将悬浊液摇动过夜后，进行离心收集上清；将离心后的上清液再用过滤器过滤并分装后，冷冻保存待用；2）人血管内皮细胞培养：将扩增培养好的细胞经胰酶消化以后，制备成细胞悬液，向6 cm培养皿中加入一定体积的细胞悬液，于37 ℃、5 % CO2条件下培养过夜；3）配置实验试剂：（1）细胞培养液，（2）磷酸盐缓冲溶液（PBS），（3）0.05%的胰酶，（4）PI溶液；（5）阴性对照培养基；4）烟草制品溶液染毒：用细胞培养液将不同的烟草制品溶液调整到合适浓度，加入到培养过夜的细胞中，进行暴露染毒；5）样品处理及细胞凋亡检测：细胞染毒1小时，PBS漂洗后用胰酶消化制备成细胞悬液，经过离心重悬后，加入Annexin V‑FITC溶液和PI溶液，避光室温孵育一定时间后，PBS漂洗，再经过离心重悬，进行流式细胞仪检测；6）结果分析：（1）横坐标代表Annexin V，纵坐标代表PI；（2）以坐标轴为中心，右上第一象限代表发生坏死的细胞，第二象限代表死细胞，第三象限代表正常细胞，第四象限代表发生凋亡的细胞。