[发明专利]一种农杆菌介导的大麻转基因方法

摘要

一种农杆菌介导的大麻转基因方法，包括以下步骤（1）将大麻种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于芽诱导培养基；（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，浸染子叶外植体并进行共培养；（4）用无菌水冲洗子叶5‑10遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中培养，得大麻小苗；（5）将所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中培养，得大麻转基因苗；（6）转入水培液或基质中进行驯化。本发明首次建立了大麻转基因体系，通过转基因方法将目的外源基因导入到大麻中，为大麻品种改良和基因功能研究等打下了基础。

主权项

一种农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将大麻种子经无菌处理、播种，得到3日龄种子无菌苗；（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆和α‑萘乙酸的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为0.1‑2mg/L，α‑萘乙酸浓度为0.01‑0.2mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂6‑7g/L，pH5.5‑6.0，光照强度2200‑2600lx，光照时间16‑18h/d，温度24±2℃，培养时间为0‑4天；（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，7000‑9000rpm离心8‑12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8‑1.0，加入乙酰丁香酮, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为90‑110mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为0.1‑2mg/L，α‑萘乙酸浓度为0.01‑0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶20‑240分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养1‑4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1‑2mg/L，α‑萘乙酸0.01‑0.2mg/L ，乙酰丁香酮90‑110mmol/L；（4）用含有300‑600mg/L头孢霉素和300‑600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22‑28天，得大麻小苗；所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1‑2mg/L，α‑萘乙酸0.01‑0.2mg/L ，头孢霉素300‑600mg/L，羧苄青霉素300‑600mg/L，筛选剂；（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS培养基，含吲哚乙酸0.01‑0.2mg/L，筛选剂；培养30‑60天，得大麻转基因苗；（6）将步骤（5）所得大麻转基因苗转入水培液或基质中进行驯化。