[发明专利]一种鸡Fowlicidins‑1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法

摘要

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种鸡Fowlicidins‑1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法。本发明利用pPIC9K载体与Fowlicidin‑1优化序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株SMDFW，通过优化甲醇诱导、表达条件，成功高效表达了具有生物活性的鸡Fowlicidins‑1抗菌肽。

主权项

一种鸡Fowlicidins‑1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、构建重组菌株SMDFW1.1、依据Fowlicidin‑1氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子的使用偏好性，设计如SEQ ID No.1所示的Fowlicidin‑1核苷酸序列；1.2、将pPIC9K载体和Fowlicidin‑1核苷酸序列分别进行EcoR I和Not I双酶切；1.3、将双酶切产物连接后，获得重组载体pPIC9K‑Fowlicidin‑1；1.4、将重组载体pPIC9K‑Fowlicidin‑1转化至毕赤酵母菌SMD1168感受态细胞；取转化菌液均匀凃于MD平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，获得重组菌株SMDFW，冻干备用；（2）、种子发酵培养：将冻干菌株SMDFW接入种子发酵培养基中，28~30 ℃、200~250 rpm振摇培养，待菌体浓度增长至OD600 =2.0~4.0时，按照上一级培养液∶下一级种子发酵培养基≤1∶10的体积比逐级扩大培养，扩大培养的条件为：搅拌速率450~550 rpm、通气量1.5~2 .5vvm、时间22~24 h；（3）、诱导发酵培养将步骤（2）所得种子发酵培养液按≤1∶4的体积比接入诱导发酵培养基中，在搅拌速率450~550 rpm、通气量1.5~2 .5vvm条件下发酵；在该过程中，利用氨水稳定发酵液的pH为6.0~6.2，同时监测溶氧量；（4）、流加补料4.1、在步骤（3）诱导发酵培养液的溶氧量开始上升时，开始流加温度≥30 ℃的葡萄糖溶液；每500 L步骤（2）所得种子发酵培养液流加葡萄糖溶液330~350 L，流加时间为13~15 h；在该过程中，控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%；4.2、流加葡萄糖溶液完毕后，待溶氧量上升至80~85%后，计时2.5~3h；4.3、利用氨水将发酵液的pH调至6.6~7.0，加入蛋白胨与酵母粉的混合液后，计时30 ~35min；每500 L步骤（2）所得种子发酵培养液加蛋白胨与酵母粉的混合液330~350 L；4.4、控制发酵液温度在29±0.2℃，开始多点均匀同时流加甲醇和维生素溶液，其中甲醇中含有12~13 mL/L的微量元素溶液，甲醇的流加总速度为7400~7500 mL/h，维生素溶液的总流加速度为90~95 mL/h，在该过程中，也控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%，待流加58~60 h后，结束反应，收集发酵液上清；上述步骤中：以1L计，所述种子发酵培养基的组成为：磷酸二氢钾11.0~12.0g、磷酸氢二钾2.0~2.5g、七水硫酸镁9.0~11.0g、硫酸铵9.0~11.0g、氯化钙0.30~0.35g、氯化钠0.8~1.2g、氯化钾0.8~1.2g、葡萄糖 25~35g、维生素溶液0.8~1.2mL、微量元素溶液4.0~4.5mL，余量为水；pH为6.0~6.2；以1L计，所述诱导发酵培养基的组成为：浓磷酸26.5~ 27.0mL、硫酸钙0.90~0.95g、硫酸钾18.0~18.5g、七水硫酸镁14.5~15.0g、氢氧化钾4.0~4.2g、葡萄糖 25~35g、维生素溶液0.8~1.2mL、微量元素溶液4.0~4.5mL，余量为水；pH为6.0~6.2；以1L计，所述葡萄糖溶液的组成为：葡萄糖450~550g、维生素溶液3.6~4.4mL、微量元素溶液11~13mL，余量为水；以350 L计，所述蛋白胨与酵母粉的混合液的组成为：45~55 kg蛋白胨、20~30 kg酵母粉，余量为水；以1L计，所述维生素溶液的组成为：生物素0.7~0.9g、泛酸钙18~22g、维生素B1 14~16g、肌醇15~17g、烟酸9~11g、维生素B6 3~5g，余量为水；pH为7.0~7.2；以1L计，所述微量元素溶液的组成为：五水硫酸铜 5.5~6.0g、碘化钠 0.08~0.09g、硫酸锰3.0~3.2g、钼酸钠0.2~0.3g、硼酸0.02~0.03g、氯化钴0.5~0.6g、氯化锌20~22g、七水硫酸亚铁65~70g、浓硫酸4~5mL。