[发明专利]一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法

摘要

本发明公开了一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法，属于分子检测领域。本发明在单个杂交链式反应HCR的基础上，通过设计两级HCR反应，在单个HCR反应基础上达到了信号的进一步扩增，最终一个目标物可以使多个标记有不同荧光染料的发夹核酸探针之间发生交替杂交，形成枝状的DNA纳米结构，通过荧光共振能量转移提供信号输出，根据荧光团的荧光强度改变值判断目标核酸的浓度。本方法可用于DNA和miRNA的体外检测，特异性好，灵敏度高。本方法还可用于细胞内的miRNA的成像分析，有利于实现癌症的早期诊断。

主权项

一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）发卡探针的设计：目标DNA（I）为含起始序列a*、b*的序列，运用NUPACK软件设计发卡探针H1、H2、H3、H4、H5、H6；上游HCR‑1包含H1、H2两个发卡，H1包括a、b、c、b*四个部分，其中b与b*互补成双链作为H1茎部，c为发卡结构的环部，a为H1的5’端单链黏性末端；H2包括d、b*、a*、b、c*和e五个部分，其中b与b*互补成双链作为H2茎部，a*为发卡结构的环部，c*为H2的3’端单链黏性末端，H2的5’端延伸出一段d序列，d序列中有2‑6个碱基封闭在H2的茎端，H2的3’端延伸出一段e序列；目标物的a*、b*先跟H1中a、b杂交从而打开H1，H1被打开后释放出c、b*，H1中c、b*可以与H2中的b、c*杂交，H2被打开后释放出a*、b*，该释放出来的序列与目标物的序列一样，因此被打开后的H2又可以跟H1杂交，最终一个目标就可以引发多个H1、H2之间的相互杂交，形成一条很长的DNA纳米线（HCR‑1）；在没有目标物I时，发卡H1、H2能保持自身的稳定性，无法发生HCR‑1反应；当有目标物I时，就可以引发HCR‑1反应，HCR‑1产物可以用I‑(H1‑H2)N表示，即一个目标可以引发多个H1、H2之间的相互杂交；当形成HCR‑1产物后，两个相邻H2的3’端和5’端靠近使d、e序列靠近以及H2中部分封闭在茎端的d序列完全裸露出来，该靠近的d‑e序列可以作为引发链T引发下游HCR‑2反应，下游HCR‑2包含H3、H4、H5、H6四个发卡，H3包括d、f、d*、e*，其3’端标记有TAMRA荧光团，f为H3的发卡结构的环部，e*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H3茎部；H4包括f*、d*、g、d，g为H4的发卡结构的环部，f*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H4茎部；H5包括d、h、d*、g*，其5’端标记有FAM荧光团, 为报告荧光基团，h为H5的发卡结构的环部，g*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H5茎部；H6包括h*、d*、e、d，e为H6的发卡结构的环部，h*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H6茎部；HCR‑1产物中靠近的d‑e序列先跟H3中d*、e*杂交从而打开H3，H3被打开后释放出d、f，H3中d、f可以与H4中的d*、f*杂交，H4被打开后释放出d、g，H4中d、g可以与H5中的d*、g*杂交，H5被打开后释放出d、h，H5中d、h可以与H6中的d*、h*杂交，H6被打开后释放出d、e，该释放出来的序列与T序列一样，因此被打开后的H6又可以跟H3杂交，最终一个目标就可以引发多个H3、H4、H5、H6之间的相互杂交，形成一条很长的DNA纳米线（HCR‑2），该产物可以用T‑(H3‑H4‑H5‑H6)N表示；由于H3上标记有TAMRA荧光团，H5上标记有FAM荧光团，目标DNA（I）引发HCR‑1和HCR‑2反应后导致两个荧光团相互靠近，发生荧光共振能量转移，提供信号输出；只有发生HCR‑1反应后，两个相邻H2的3’端和5’端靠近使d、e序列靠近以及H2中部分封闭在颈端的d序列完全裸露出来，该靠近的d‑e序列可以作为T引发下游HCR‑2反应，即目标DNA（I）引发HCR‑1反应，HCR‑1产物可以引发HCR‑2反应；或者，当检测目标物miRNA时，运用NUPACK软件设计发卡探针H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7；H7的5’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA完全互补， a*、b*为H7发卡结构的环部；H1‑H6的序列设计要求同目标为DNA（I）的设计要求；首先利用miRNA识别并打开H7，发卡H7被打开后释放起始序列a*‑b*，此处的序列a*‑b*与目标DNA（I）的序列a*、b*都是引发级联HCR的起始序列，因此被打开后的H7可以引发上游HCR‑1反应，继而可以引发下游HCR‑2反应，发生荧光共振能量转移，提供信号输出；（2）基于级联杂交链式反应实现DNA的检测：在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液（HEPES）中，将所有发卡探针（H1、H2、H3、H4、H5、H6均为200 nM）与目标DNA混合，在室温下孵育2 h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；或者，基于级联杂交链式反应实现miRNA的检测：在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液中，将所有发卡探针（H1、H2、H3、H4、H5、H6均为200 nM，H7为50 nM）与miRNA混合，在室温下孵育2 h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；所述的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液浓度为10 mM，pH为7.2，含1 M NaCl和50 mM MgCl2。