[发明专利]一种评价EML4‑ALK抑制剂对肺癌治疗效果的方法

摘要

本发明公开了一种评价药物对EML4‑ALK L1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，该方法是在体外构建5’mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA基因片段，然后将该基因片段与cas9酶和gRNA共同注射到小鼠的胚胎中，小鼠出生后鉴定含有同源重组基因的小鼠，待小鼠发育至成年，激活EML4‑ALK L1196M癌基因，就会诱发肺癌的原位瘤，然后对小鼠给药治疗，评价治疗效果。本发明的评价方法能真实地模拟肺癌的临床过程，利用本发明的小鼠模型能准确地预测一个药物在肺癌临床中的表现准确评价药物的急性毒性、慢性毒性、药代动力学、对肺癌的治疗效果。

主权项

一种评价药物对EML4‑ALK L1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用PCR方法扩增EML4‑ALK L1196M基因片段并在其5’端和3’端分别加上EcoRI和NotI酶切位点，将所得到的片段连接到pClatent质粒上，得到pClatent‑EML4‑ALK L1196M质粒；用PCR方法扩增小鼠ROSA26位点两段序列作为同源臂，分别通过EcoRV和PacI、EcoRV和AscI插入到pClatent‑EML4‑ALK L1196M质粒上，从而得到mRosa‑lsl‑EML4‑ALK L1196M质粒；用EcoRV酶将质粒上的载体片段切掉，得到5’mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA基因片段；步骤(1)所述的加上酶切位点的EML4‑ALK L1196M基因片段的序列如SEQ.ID.NO.1所示；步骤(1)所述小鼠ROSA26位点两段序列分别如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；步骤(1)所述的5’‑mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA基因片段其序列如SEQ.ID.NO.11所示；(2)将Cas9mRNA片段、gRNA片段和可诱导表达EML4‑ALK L1196M的转基因片段5’mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA混合，通过显微注射将混合物注射到小鼠的胚胎中，cas9在gRNA的引导下切开ROSA26位点，通过同源重组将可诱导表达的基因片段插入基因组；步骤(2)所述的gRNA，其序列如SEQ.ID.NO.12所示；(3)将步骤(2)得到的转基因胚胎移植入代孕鼠子宫，饲养并待小鼠出生，设计三对引物分别对5’插入位点、3’插入位点和EML4‑ALK L1196M基因进行PCR鉴定，筛选全部阳性的转基因小鼠；(4)转基因阳性的小鼠饲养至成年，把含有CRE重组蛋白酶基因的病毒从鼻腔滴入小鼠肺中，从而将肺上皮细胞中的EML4‑ALK L1196M癌基因激活，20天后小鼠得肺腺癌；通过CT检测和病理切片证实肺癌组织的存在；(5)对小鼠给药，给药结束，CT检测肺癌大小，与治疗前的大小进行比较；(6)治疗结束后，处死小鼠，制备小鼠肺组织的病理切片，读取病理切片上的肺癌病理变化；再与CT检测结果结合，判断药物治疗EML4‑ALK L1196M驱动肺癌的能力。