[发明专利]猪带绦虫重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法

摘要

本发明公开了猪带绦虫重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法，包含TSOL18基因合成和引物设计、重组质粒pMG36e‑TSOL18的构建及鉴定、猪带绦虫重组pMG36e‑TSOL18/L.lactis的构建及鉴定和蛋白表达鉴定等步骤。以乳酸乳球菌MG1363为宿主系统进行基因优化，合成目的基因TSOL18。双酶切连接至pMG36e载体，构建胞内型表达载体pMG36e‑TSOL18，再将其电穿孔转化至L.lactis MG1363，成功构建猪带绦虫乳酸乳球菌表达系统pMG36e‑TSOL18/L.lactis MG1363。进行PCR鉴定、SDS‑PAGE和Western blot分析TSOL18基因在胞内检测到目标蛋白表达，通过AKTA蛋白纯化鉴定及稳定性分析，pMG36e‑TSOL18质粒在L.lactis MG1363中连续传代20代，有较好的遗传稳定性，为猪囊尾蚴病疫苗的开发与利用提供了有力的参考依据。

主权项

猪带绦虫重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法，其特征是，包含以下步骤：1)、TSOL18基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSOL18基因序列，采用基于PAS的方法，在引物的两端各设计了Sac I和Hind III酶切位点和保护性碱基，合成576bp的TSOL18基因；2)、重组质粒pMG36e‑TSOL18的构建及鉴定：合成的目的基因与表达载体pMG36e用Sac I/Hind III双酶切相连接，获得重组质粒pMG36e‑TSOL18，转化至Top克隆菌株，抽提阳性质粒测序鉴定；3)、猪带绦虫重组pMG36e‑TSOL18/L.lactis的构建及鉴定：3.1)、乳球菌的活化及感受态制备：取乳酸球菌MG1363菌液接种于GM17固体培养基平板，然后收集菌体，用1:100的甘油磷酸缓冲液重悬菌体；3.2)、重组质粒pMG36e‑TSOL18电转化MG1363：将获得的pMG36e‑TSOL18质粒与感受态MG1363混合，进行冰浴和电击，加入蔗糖MRS培养基，然后进行涂布红霉素GM17平板培养，选取阳性菌落再进行红霉素液体培养基培养；3.3)、阳性克隆鉴定：取上述3.2)步骤的培养菌液，离心弃上清，再依次进行洗涤、重悬、沸水浴、冰浴、离心，取上清作为PCR模板待用；使用基因特异性的引物进行PCR鉴定，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)、蛋白表达鉴定：4.1)、SDS‑PAGE鉴定：选取未转化的乳酸球菌培养于GM17液体培养基中，挑取步骤3.3)鉴定为阳性的菌液，离心收集沉淀和上清；将沉淀在冰浴中进行超声破碎，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴4‑8min，冷却后上样，通过SDS‑PAGE检测上清和胞内的蛋白表达情况；4.2)、通过AKTA纯化TSOL18蛋白，使用Anti‑TSOL18抗体检测纯化后的蛋白在15D左右有无目的条带；4.3)、Western blot鉴定：取AKTA纯化TSOL18蛋白进行Western blot鉴定分析。