[发明专利]用于检测多种病原体的荧光实时检测方法及应用

摘要

本发明提供了用于检测多种病原体的荧光实时检测方法及应用。具体地，本发明提供一种新的简易的荧光实时检测(RT‑)PCR方法、反应体系及其在病原(特别是病毒)的单重和多重检测和基因表达定量检测中的应用。本发明涉及一种3’末端带有荧光或淬灭基团修饰的荧光引物，其3’端不必与模板错配，在高保真DNA聚合酶的3’‑5’外切酶校正功能和任选的微量非高保真DNA聚合酶作用下，切除3端荧光或和淬灭基团，从而实现对病原体核酸和人类基因DNA、mRNA的荧光实时定量检测。本发明设计简单，操作快捷、灵敏性强、准确度高，可广泛用于传染病病原快速多重检测及基因表达定量检测等相关领域。

主权项

一种定量或定性的核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(i)在一扩增体系中，以待测核酸为模板，用M种引物对、高保真DNA聚合酶进行核酸扩增，其中，M为≥1的正整数；所述的M种引物对中，至少一种引物对为位点特异性引物对，所述位点特异性引物对包括第一引物和第二引物；其中，(a)所述第一引物结构如下式I所示：Z1‑Z2‑Z3‑F1   (I)式中，F1为荧光基团或淬灭基团；Z1为无或附加功能区，长度为L1个核苷酸；Z2为互补结合区，长度为L2个核苷酸；其中，Z1和Z2中至少一个与F2相连，其中F2为荧光基团或淬灭基团；并且F1和F2两者中一个为荧光基团，另一个为淬灭基团；Z3为3’端的位点识别区，所述识别区的长度为L3个核苷酸，并且所述的识别区与待检测的模板检测区序列是匹配或非匹配的，并且L3为1‑5；(b)所述第二引物为正常引物或与第一引物结构相同；(c)所述高保真DNA聚合酶为具有外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)检测所述扩增体系中的荧光，从而获得定量或定性的检测结果。