[发明专利]一种分选胎儿有核红细胞的方法

摘要

本发明公开了一种分选胎儿有核红细胞的方法。首先，利用表面包裹明胶的二氧化硅微球通过抗原抗体特异性识别作用捕获到血样中的胎儿有核红细胞，从而扩大靶细胞与其他血细胞的分选密度差异；然后在优化后密度为1.15g/ml的Percoll溶液作用下实现对胎儿有核红细胞的分选，最后通过基质金属蛋白酶对明胶的降解实现对靶细胞的无创伤性释放；同时，本发明提供了一种可信的对胎儿有核红细胞的免疫荧光鉴定方法。本发明具有以下优点和积极效果分选过程简单、方便，易操作；特异性强，分选纯度高；实验成本低，具有良好的应用前景。

主权项

一种分选及鉴定胎儿有核红细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）优化可进行密度分选的Percoll溶液：从美国Sigma公司购买的Percoll原液的密度是1.13g/ml，使用2.5M密度为1.316g/ml的蔗糖溶液以1:9体积比例浓缩Percoll原液，得到密度为1.15g/ml的Percoll溶液；2）制备具有明胶表面的二氧化硅微球SiO2@Gel：a. 称取0.1g粒径为30μm，密度为2.0g/ml的二氧化硅微球分散在50ml无水乙醇中，50‑80℃水浴条件下滴加0.5ml 3‑氨基丙基三乙氧基硅烷磁力搅拌2‑4h，然后经过无水乙醇、去离子水洗涤3次后得到氨基修饰的二氧化硅微球NH2‑SiO2；b.将NH2‑SiO2重新分散在50ml去离子水中，加入0.5mL 浓度为 50%的戊二醛，室温搅拌8‑13h，离心收集到的微球经过去离子水离心洗涤 3 次后得到醛基修饰的二氧化硅微球CHO‑SiO2；c.将CHO‑SiO2再次分散到浓度为1%的明胶溶液，室温搅拌2‑5h后用去离子水离心洗涤 3 次得到表面均匀包裹上一层 10‑50nm 明胶的二氧化硅微球 SiO2@Gel；步骤2）个步骤中的离心转速设定为 1000转/分钟；3）制备抗体anti‑CD147修饰的SiO2@Gel微球：a.用吗啉乙磺酸（MES）溶液洗涤SiO2@Gel微球三次，然后将SiO2@Gel微球浸泡在适量MES溶液中；b.在a中的微球溶液里分别加入EDC和NHS，反应20‑40min后，用PBS洗涤3遍；c.将b处理的微球浸入链霉亲和素溶液中，过夜处理，用PBS洗涤；d.对c处理的微球进行anti‑CD147修饰1‑3h，抗体anti‑CD147的浓度优选为20μg/ml，用PBS洗涤得到抗体修饰的SiO2@Gel微球；4）分选胎儿有核红细胞：将含有胎儿有核红细胞的1毫升样品与105/毫升抗体修饰的SiO2@Gel微球在细胞混匀仪室温下搅拌30min，转速设定为10rpm，混匀孵育得到混合样品，加入到步骤1）通过优化密度后的Percoll溶液，在400g离心15min，，在离心管底部收集到捕获细胞的微球；5）胎儿有核红细胞的无创伤性释放：将收集的捕获到胎儿有核红细胞的二氧化硅微球SiO2@Gel用明胶酶进行降解释放胎儿有核红细胞；6）释放下来的胎儿有核红细胞的鉴定：以激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，结合DAPI，对步骤5）释放的胎儿有核红细胞进行识别，以双抗体同时标记为阳性且细胞核在紫外光激发下呈蓝色作为胎儿有核红细胞鉴定的标准。