[发明专利]一种PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备方法及其应用

摘要

一种PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子的制备方法及其应用，属于生物分析技术领域。本发明以磁性Fe₃O₄为内核，磁性Fe₃O₄包裹SiO₂，再制备获得PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子，形成了PQQ‑DA表面具有高识别性、高选择性的磁性纳米粒子印迹材料。这种特异性的磁性纳米粒子进行分子印迹修饰后，对目标物同时具有磁性及特异选择性，对复杂基质的脑组织中低浓度化合物的分离、净化和富集具有很大的优势。制备的PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子用于UPLC‑MS测定生物体内PQQ‑DA痕量分析。本发明建立了基于分子印迹固相萃取的UPLC‑MS，能检测到小鼠脑内痕量PQQ‑DA的含量，检测限达到0.2×10^‑11 mg/mL。对神经系统疾病的发生和机理研究具有重要指导意义。

主权项

1.一种PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤为：（1）Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：100mL 1.25mM FeSO₄·7H₂O 在氮气的保护下以 800 rpm机械搅拌，用6M NaOH溶液调pH至10.0，1h后磁性沉淀物分离，用磁铁吸附黑色 Fe₃O₄ 纳米粒子，倒去上层液体，用二次蒸馏水及乙醇分别洗涤三次，再分散悬浮于乙醇溶液中得到 5.0 mg/mL 的纳米Fe₃O₄ 溶液；（2）磁性Fe₃O₄包裹SiO₂的制备：将 50 mL制备得到的Fe₃O₄悬浮液中加入5mL 氨水，5 mL 二次蒸馏水，10 mL含1mM四甲氧基硅烷，60℃800 rpm机械搅拌10 h；加入200μL 3‑（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷分散于 50 mL 10%的醋酸水溶液中，继续搅拌 5h，用二次蒸馏水洗涤，得到磁性Fe₃O₄/ SiO₂纳米粒子；（3）PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子的制备：取0.46g PQQ‑DA加入 30 mL含0.2M甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超声混合30 min，N₂保护下滴加5.0 g乙二醇二甲基丙烯酸酯和 0.02 g偶氮二异丁腈，加入 0.25 g 磁性Fe₃O₄/ SiO₂纳米粒子，超声30 min；将此混合液 60℃反应 24h，得PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子；非印迹磁性纳米粒子的制备除了不加模板分子PQQ‑DA外，其他步骤和印迹磁性纳米粒子相同；用v/v为5/1的乙醇‑甲酸混合液洗涤三次，再用二次蒸馏水洗涤三次，用外部磁场分离出磁性纳米粒子，真空干燥，分别得到磁性印迹聚合物及磁性非印迹聚合物；（4）采用扫描电镜观察分子印迹聚合物表面，用红外光谱对分子印迹聚合物的化学结构进行表征；（5）吸附实验吸附热力学特性：移取5 mL浓度分别为0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、及4.0 mg／mL的PQQ‑DA溶液，分别置于锥形瓶中；分别称取15 mg的磁性印迹聚合物及磁性非印迹聚合物，分散于不同浓度的PQQ‑DA溶液中，15℃水浴恒温振荡10 h后用磁铁将粒子吸在底部，UPLC‑MS测定上清液中的PQQ‑DA量；以印迹磁性纳米粒子的吸附容量对PQQ‑DA的初始浓度作图，绘制等温吸附线；（6）印迹磁性纳米粒子用量对回收率的影响吸附剂用量对目标物的回收率具有重要影响，粒子用量不够，不能完全吸附目标物；粒子用量过多，虽可确保目标物被充分吸附，但会影响洗脱，导致提取效率降低；研究了不同印迹磁性纳米粒子用量2.5、5、10、15、20、25mg对PQQ‑DA回收效率的影响；当使用10 mg 印迹磁性纳米粒子时，回收率达到93.5％，继续增大印迹磁性纳米粒子用量，回收率反而下降；（7）脱附时间的影响脱附时间对回收率有着很大的影响，为了获得最佳脱附时间，将吸附饱和的印迹磁性纳米粒子分散于2 mL乙醇／甲酸溶液中，置于摇床中振荡洗脱，考察不同振荡洗脱时间的回收率，随着洗脱时间的增大，回收率也逐渐增大，洗脱20 min回收率达到93.6％，洗脱达到平衡，在实际样品分析时选择20 min为洗脱时间。