[发明专利]一种水稻诱导抗病基因OsAAA1启动子及其载体与构建方法

摘要

本发明提供了一种水稻诱导抗病基因OsAAA1启动子，所述启动子受水杨酸诱导表达，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其长度为2893bp。本发明同时还提供了所述水稻诱导抗病基因OsAAA1启动子的双元表达载体DX2181G，并提供了双元表达载体DX2181G的构建方法。本申请中成功构建了该启动子的双元表达载体DX2181G，通过农杆菌介导的遗传转化转入水稻品种日本晴，转基因植株阳性鉴定后，进行GFP观察分析来研究OsAAA1启动子的表达模式和OsAAA1基因的调控机制。

主权项

1.水稻诱导抗病基因OsAAA1启动子的双元表达载体DX2181G的构建方法，所述启动子受水杨酸诱导表达，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其长度为2893bp，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：(1)、针对水稻诱导抗病基因OsAAA1启动子设计引物，上游引物为AA2PSalF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物为AA2PSalR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；(2)、对OsAAA1基因启动子进行PCR扩增，PCR反应体系为：ddH₂O 10.025μL，10×Ex Taq buffer 1.5μL，Ex Taq酶0.075μL，2.5mmol/μL dNTPs 1.2ul，10mmol/L的正反引物各0.6μL，100ng/μL DNA模板1μL；PCR扩增程序为：95℃3min；95℃变性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸60s，34个循环；72℃延伸7min；将检测正确的PCR产物用凝胶回收试剂盒回收；(3)、将回收的PCR产物与DX2181质粒进行Sal Ⅰ酶酶切，反应体系为：10×H Buffer 5μL，Sal Ⅰ 2μL，线性质粒10μL，ddH₂O补足至50μL；将目的片段酶切后进行清洁回收，将酶切的DX2181质粒进行去磷酸化处理后与回收的目的片段进行连接，反应体系为：目的片段1.5μL，DX2181质粒1.5μL，Ligation high连接酶3μL，16℃连接90min；连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂含50μg/mL的卡那霉素的LB平板，置于培养箱37℃倒置培养16h，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，提取质粒DNA进行酶切鉴定，对鉴定到的阳性克隆测序确认。