[发明专利]一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法

摘要

本发明提供了一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法，本发明所述数字核酸分析方法是以引物标记的磁珠为载体，在乳液中发生滚环扩增反应，磁珠在反应后生成大量的扩增产物并捕捉与之互补的荧光标记引物，形成磁珠‑扩增产物‑荧光标记引物的复合物，反应后的乳液经破乳后收集反应磁珠，使用显微镜和流式细胞仪采集磁珠的荧光信号，通过对荧光磁珠数的计数实现对目标DNA的数字核酸分析。本发明所述的一种乳液中进行滚环扩增的数字核酸分析方法利用滚环扩增的优势缩短了时间、提高了效率，该方法为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的数字核酸分析手段。

主权项

1.一种乳液中进行滚环扩增的体外非诊断性的数字核酸分析方法，其特征在于：使用挂锁探针、滚环扩增引物P1和滚环扩增引物P2进行滚环扩增，其中：所述挂锁探针的寡核苷酸序列为：p‑CCA GAT GTA GCT TGT AAG ATG AAG ATA GCG CAC AAT GGT CGAATT CTC AAC CCC TAC GCG AGA CCC AGT AG；所述滚环扩增引物P1的寡核苷酸序列为：Biotin‑TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACCATTGTGCGCTATCTTCA；所述滚环扩增引物P2的寡核苷酸序列为：Cy5‑ATGGTCGAATTCTCAACCCCTA；所述滚环扩增包括如下步骤：(1)制备滚环扩增引物结合的磁珠：用缓冲溶液洗涤链霉亲和素包被的直径0.5～2μm磁珠，将磁珠悬浮在缓冲溶液中，将生物素标记的滚环扩增引物P1加入缓冲溶液中，室温下孵育15～30分钟，然后将磁珠用TE缓冲液洗涤三次，制得滚环扩增引物P1结合的磁珠；(2)合成环探针溶液：将挂锁探针和待测核酸在95℃下孵育3分钟后，然后在52℃、47℃、42℃下各孵育30分钟后将混合物冷却至室温，加入连接酶、连接酶反应缓冲液，反应1～3h，然后灭活连接酶，制得环探针溶液；(3)捕获环探针：将步骤(1)制得的滚环扩增引物P1结合的磁珠加入到步骤(2)中制得的环探针溶液中，放置于摇床，反应0.5～2h，制得捕获环探针的磁珠；(4)制备乳液：所述乳液包括水相和油相，其中：a、水相制备：将步骤(3)中已捕获环探针的磁珠、13μL浓度为20μM的滚环扩增引物P2、20μL浓度为10mM的dNTP、2μL浓度为1mg/mL的BSA、4μL浓度为8UμL^‑1的Bst 2.0Warmstart聚合酶混合均匀，加灭菌超纯水至100μL，制得水相；b、油相制备：将DC5225C、DC749、Ar20以质量比为40％、30％、30％混合均匀，制得油相；c、形成乳液：将一个直径3毫米钢珠加入2毫升的反应管中，加入100μL水相和200μL油相，调整组织研磨器的频率为28HZ，研磨时间为5分钟，使其形成水相液滴直径约为3‑10μm的稳定乳液；(5)破乳收集磁珠：在制得乳液的反应管中加入异丙醇，破乳洗涤，离心弃去上清液，收集磁珠；(6)将步骤(5)收集的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；(7)将步骤(5)收集的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。