[发明专利]猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法

摘要

本发明涉及用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤将BHK21细胞复苏后接入转瓶中培养至细胞长成片后，接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，继续培养，待细胞病变CPE达90％以上，收获细胞毒液，将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品，即得。采用本发明提供的疫苗生产方法收获的猪伪狂犬gE基因缺失病毒液的病毒含量高，达≥107.2TCID50/mL，且具有较强的免疫原性，不需要添加免疫增强剂即可达到好的免疫效果，经免疫后可促进体内分泌中和抗体，免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。

主权项

一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将种子细胞BHK21进行复苏，然后接入转瓶中，加入细胞生长液，置于转瓶机上培养，培养条件为：转速15~20 r/min、pH值7.2~7.4、温度36.5~37.5℃；（2）待步骤（1）中转瓶培养的BHK21细胞长成片后接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，接入毒种的感染复数为0.01，在转速为15~20r/min，pH值为7.2~7.4、温度为35.5~36.5℃的培养条件下培养12h，使病毒与细胞充分接触吸附，然后将转速设为5~10r/min，连续培养4~5天，待细胞病变CPE达90%以上，收获细胞毒液；（3）将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品，即得；其中，所述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10%新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5%CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02%EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6~8min，使用含10%新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2~4×105个/mL的细胞悬液；所述的细胞生长液为含有4~8 mmol/L谷氨酰胺、0.4~1.2mg/L二亚油酰磷脂酰 胆碱、2~6% (m/v) D‑氨基葡萄糖、2~4% (m/v)生长促进剂、1.0~1.2% (v/v)双抗的DMEM培养液；所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05~0.2的质量比组成，所述的活性矿物酵母多肽为购自美国艾缇科技公司的ACB Bio‑Chelate 5。