[发明专利]一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法

摘要

本发明公开了一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，用于生物制造领域，采用复合生物3D打印、电流体动力学直写、减材制造和细胞组装技术在大块生物骨支架内部构建功能性预制血管化网络来促进大块骨缺损的修复。此方法的关键在于采用可在体内讲解的生物材料海藻酸钠作为牺牲材料，并在其中加载内皮细胞，通过内皮细胞自身的迁移粘附到预制血管网络表面，与此同时，海藻酸钠降解形成预制血管网络；此外，骨支架材料中的人骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞，并与内皮细胞的相互促进作用下合成分泌骨基质，并矿化，提高骨组织修复的效率，解决了大块骨组织修复的功能性问题，对临床医学上解决大块骨组织修复问题具有重要意义。

主权项

一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，其特征在于，包括如下步骤：a.配制载有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ作为牺牲材料：将经高温烘烤并经紫外灯消毒的水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ粉末分别倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的水凝胶Ⅰ溶液和水凝胶Ⅱ溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心步骤后，倒掉上清液，分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入水凝胶Ⅰ溶液和水凝胶Ⅱ溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ溶液和含有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ溶液；b.将步骤a获得的含有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ溶液倒入一支10mL医用注射器中，供宏观挤出打印骨支架使用，将含有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ溶液倒入两支10mL医用注射器中，分别供挤出打印宏观尺度牺牲模块和电流体动力学直写微观尺度牺牲模块使用；c.将步骤b获得的三只装有打印材料的医用针管分别装载在打印平台上，开始打印：首先接收平台移动到宏观挤出工位打印骨支架材料，形成骨支架基底；而后接收平台移动到另一宏观挤出工位打印宏观尺度牺牲材料，形成宏观尺度牺牲结构；最后接收平台移动到电流体动力学直写工位打印微观尺度牺牲材料，形成微观尺度牺牲结构，至此，经过三个工位的转换完成一层同时含有骨支架材料和宏微观尺度牺牲材料的打印；最终，三个工位在运动程序的控制下不断转换并复合打印成形含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架；d.将步骤c中制备的含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架放置在含有细胞培养液、环境条件为37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，宏微观尺度牺牲结构随着培养周期逐渐降解，在骨支架内部形成多尺度三维预制血管网络；同时，宏微观尺度牺牲结构中的内皮细胞逐渐迁移到牺牲结构表面并粘附到多尺度三维预制血管网络形成内皮细胞层；e．步骤d中获得的含有多尺度三维预制血管网络表面粘附有内皮细胞层，随着培养周期的增加，内皮细胞相互作用，逐渐形成血管网络；由于内皮细胞的存在，骨支架材料中的骨髓间充质干细胞逐渐分化为成骨细胞，在与内皮细胞的相互促进作用过程中，成骨细胞加速合成分泌骨基质并矿化，内皮细胞则加速血管网络的形成，从而实现功能性大块生物骨支架的制备，加速大块骨缺损的修复。