[发明专利]检测柑橘铁螯合还原酶家族基因的方法

摘要

本发明公开了一种检测柑橘铁螯合还原酶家族基因的方法，包括步骤：1)选取1年生的资阳香橙、卡里佐枳橙和枳的实生苗用作组织表达分析的材料；2)提取各实生苗根、茎、叶组织的RNA；3)以步骤2)提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一条链；4)荧光定量PCR；5)采用2△Ct法分析试验所得数据。本发明检测柑橘铁螯合还原酶家族基因的方法，通过特定的引物和反应体系，分别鉴定出了5种铁螯合还原酶基因在各种柑橘的不同部位的表达情况，有利于研究柑橘的耐缺铁特性。

主权项

一种检测柑橘铁螯合还原酶家族基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)选取资阳香橙、卡里佐枳橙和枳的根、茎和叶用作表达分析的材料；2)分别提取资阳香橙、卡里佐枳橙和枳的根、茎、叶组织的RNA；3)以步骤2)提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一条链；4)荧光定量PCR；柑橘中各铁螯合还原酶基因的荧光定量引物分布于基因的不同外显子区，引物的序列如下：FRO1基因的上游引物为5'‑AGGCACCCTTTACTACCTCCTAC‑3'，下游引物为5'‑GACAAGACTTCCCTTCGTTGATA‑3'；FRO2基因的上游引物为5'‑CATGCTGGGCATTTCTCTTCTT‑3'，下游引物为5'‑GTTTCGCTCCATTCTAGCACCT‑3'；FRO3基因的上游引物为5′‑CCAGCTTTGAGATTCTGTTGGT‑3′，下游引物为5′‑GGTACTTGAGTTGCCATGTGTT‑3′；FRO4基因的上游引物为5′‑GACCTGAGCTAAAGAGGATGCT‑3′，下游引物为5′‑GCCAGACCAGATGAACAGATTG‑3′；FRO5基因的上游引物为5′‑CCATTTTACAGGGCACGACAT‑3′，下游引物为5′‑ATTATTGGCCAAAGAGAGCAGC‑3′；PCR反应体系为：SYBR GreenⅠ20μL，iQ SYBR MIX 10μL，浓度为10μmol·L‑1的上游引物和下游引物各0.3μL，cDNA 5μL，ddH2O 4.4μL；选取看家基因Actin为内参基因，采用温度循环为94℃‑60℃‑72℃三步法进行qRT‑PCR，PCR反应程序为：95℃预变性1min；94℃10s，60℃15s，72℃15s，40个循环；5)采用2△Ct法进行计算分析试验所得数据，2△Ct法即每百万看家基因中FROs数目＝106×2Ct(Actin)－Ct(FRO)。