[发明专利]一种构建石榴品种身份证的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种构建石榴品种身份证的方法及其应用，该方法包括以下步骤在苗期摘取不同石榴品种资源的叶片，用于DNA的提取；利用该SSR分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR反应；电泳检测；数据分析。本发明构建了具查询功能的SSR指纹网络数据库，实现对不同地区石榴资源的准确区分，成功地将分子标记辅助选择育种技术应用于现实的石榴育种工作中，为检测单位和育种工作者提供了一个便利的网络数据交换和共享平台。在不同性状石榴的选育工作中，为杂交石榴品种真实性和纯度鉴定提供理论基础，可以显著降低石榴育种的工作量，提高亲本选择的准确性和目的性，缩短育种时间，极大地提高育种效率。

主权项

一种构建石榴品种身份证的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在苗期摘取不同石榴品种资源的叶片，用于DNA的提取；步骤2、利用该SSR分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR分析；用于石榴品种指纹分析的13对SSR标记引物，由北京阅微生物技术有限公司合成,并分别用FAM蓝色、HEX绿色、TAMRA黄色、ROX红色4种荧光基团修饰上游引物5′端；步骤3、PCR反应体系如下：10×Buffer I 1.5μl，2.5mM dNTP 1.2μl，TP‑M13 1μl，特异引物1μl，TAKARA HS Taq 0.1μl，DNA 1.2μl，加ddH2O补齐至15μl；步骤4、PCR反应程序：(1)引物2363，14870，68159，16262，16942，5347的PCR反应程序为95℃5min，94℃30s，56℃30s，35个循环，然后94℃30s，53℃30s，72℃30s，15个循环，最后60℃30min，共50个循环；(2)引物34768，18616，27944，37300，41575，47743，61814的PCR反应程序为95℃5min，94℃30s，58℃降到48℃30s，72℃30s，10个循环，94℃30s，48℃30s，72℃30s，20个循环，95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环，最后60℃30min，共40个循环；步骤5、电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，PCR产物1.0μl，其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5：8.5；将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离子甲酰胺、0.5μl LIZ‑500分子量内标和1μl稀释后的PCR产物，95℃变性3min，于4℃放置10min，4000转min‑1离心1min，于ABI3730 DNA分析仪上进行毛细管电泳；预电泳15kV，3min；2kV电进样10s；电泳15kV，20min；步骤6、数据分析用Data Collection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ‑500分子量内标，获得SSR扩增片段的精确分子量bp；将石榴品种的DNA指纹信息编码，再结合品种的形态学特征特性及可能具有的特异基因信息，构建136份不同地区石榴资源品种的分子身份证，并利用在线条码生成器http://barcode.tecit.combarcodege.nerator.aspx？LANG＝zhcn和二维码生成软件Encoder2以条码表述构建的石榴品种身份证。