[发明专利]石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法

摘要

本发明公开了一种石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，包括如下步骤步骤一、酶的提取，从鹅盲肠得到鹅盲肠黏膜液体并离心，接种培养得所需菌种，经过蒸馏水稀释，将稀释液调pH值后捣碎，离心，汲取上清液，即为7α‑羟化酶液，置于‑20℃以下保存，待用。步骤二、催化转化，利用7α‑羟化酶液催化石胆酸，得到鹅去氧胆酸。本发明利用鹅盲肠黏液培养得到7α‑羟化酶，原料来源广泛，成本低。而且本发明克服了常规的从鸭胆汁中提取鹅去氧胆酸的思路限制，提供一种合成鹅去氧胆酸的新思路，而且可以利用本发明的方法，使含石胆酸较高的鹅去氧胆酸不合格产品转化为鹅去氧胆酸合格产品。

主权项

石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一、酶的提取1.1收集刚宰杀家鹅盲肠部分，木片刮取肠黏膜，将得到的鹅盲肠黏膜液体置于离心管中，加少量蒸馏水稀释震荡摇匀后，离心，汲取上清液；1.2无菌环境下，将上述得到上清液接种在含0.1％石胆酸的液态LB培养基上；避光，控制温度15～25℃，接种3～4天后将培养基上长出的菌落重新接种在含1％石胆酸的液态LB培养基上，避光，控制温度15～25℃，培养3～4天，得所需菌种，0～4℃保存在试管斜面培养基上，待用；1.3将上述得到菌种，转到三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基内，避光，控制温度15～25℃，密闭培养3～4天，取出，加入占三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基的体积的1～2倍量蒸馏水稀释后，将稀释液调pH值至7.0～7.2后置入高速组织捣碎机进行捣碎2～4小时，离心，汲取上清液；1.4收集上述上清液，即为7α‑羟化酶液，置于‑20℃以下保存，待用；步骤二、催化转化2.1将石胆酸投入反应瓶中，加入0.1mol/L的三乙胺‑盐酸1：1缓冲溶液，三乙胺‑盐酸缓冲溶液用量与石胆酸用量比为15：1至25：1mL/g，搅拌下滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.2，反应30分钟至完全溶解；2.2加入7α‑羟化酶液至上述溶液，继续加入还原型辅酶Ⅱ；7α‑羟化酶液用量与石胆酸用量比为1：1至3：1mL/g，还原型辅酶Ⅱ与石胆酸用量比为1：600至1：400g/g；2.3常温下，鼓入空气，滴加稀盐酸维持pH值7.0～7.2搅拌反应8小时，高效液相色谱法分析显示石胆酸峰值消失，确认反应完全；2.4加入10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10～11，升温至50℃，搅拌30分钟；2.5加入乙酸乙酯，用50％硫酸调pH值至3～4，进行萃取，静置分去下层水层；将乙酸乙酯通过硅藻土层进行过滤；乙酸乙酯用量与石胆酸用量比为9：1至11：1mL/g；2.6 60℃下浓缩滤液至滤液体积为加入的乙酸乙酯体积的一半时，加入与滤液体积相同体积的正庚烷，缓慢搅拌，降温至0～5℃，结晶4小时，过滤得到鹅去氧胆酸精品。