[发明专利]外引物可降解的巢式PCR

摘要

本专利“外引物可降解的巢式PCR”是一种酶解代替纯化的单管两轮PCR，其特征是引物末端至中部含1个或以上dU及RNA碱基的外引物PCR于矿物油密闭下预扩放大后，其RNA/dU外引物被加入UDG及RNA酶的内引物荧光PCR酶解，以及预设外引物PCR液中过量底物和Mg2+使内PCR液不用含Mg2+，加内PCR液时矿物油层面上残留液无Mg2+而无效扩增，加上内扩UDG系统防止产物气雾胶外源污染；并采用中部同序的内引物策略进一步减少内源PD非特异性，确保≥“1”分子有效检测和“0”无扩增反应的数字dPCR方法。

主权项

外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：在单个反应管/孔中巢式PCR完成以下步骤：(1)外引物扩增：PCR管中加入修饰的外引物PCR反应液，并加入矿物油对PCR反应液进行密封，完成预定扩增程序；所述外引物PCR反应液中采用的外引物末端至中部含有1个或1个以上dU碱基和/或RNA碱基修饰，所述外引物PCR使用Taq、K Taq、H.K Taq,含1‑2×常规量的dNTP底物和Mg2+缓冲液；(2)内引物扩增：于矿物油表层下加入内引物PCR反应液稀释外引物PCR 2‑4×倍体积，所述内引物PCR反应液中含有UDG和/或RNA酶，内引物PCR前500C 2‑10分钟消化、降解外引物PCR反应液中采用的所述含有1‑3个dU碱基修饰和/或RNA碱基修饰的外引物；内引物PCR反应液含0‑1×倍量常规底物和Mg2+。