[发明专利]一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，其步骤如下：一、提取总RNA；二、反转录为cDNA；三、对反转录产物进行PCR反应；四、将THCA合成酶基因正向片段与pSKint载体连接，转化，提取质粒，酶切鉴定得到pSKTHCAihp Ⅰ；五、pSKTHCAihp Ⅰ与THCA合成酶基因反向片段进行连接，转化，提取质粒，酶切鉴定得到pSKihpTHCA；六、含有正反向THCA合成酶基因和内含子的片段与pCAMBIAsuper1300+植物表达载体进行连接，转化，提取质粒，双酶切鉴定得到植物表达载体pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA。本发明填补大麻RNAi载体构建方法的空白。

主权项

1.一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，其特征在于所述构建方法步骤如下：一、以大麻花期叶片、雄花、雌花混合样为材料，提取总RNA；二、反转录为cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；三、以反转录产物为模板，设计特异性引物，用Taq酶对反转录产物进行PCR反应，获得PCR产物并回收；四、将经Sal Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切的THCA合成酶基因正向片段与Sal Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切pSKint载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由Sal Ⅰ/HindⅢ双酶切进一步鉴定得到pSKTHCAihp Ⅰ；五、pSKTHCAihp Ⅰ经BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切与经BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切的THCA合成酶基因反向片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由Sal Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切进一步鉴定得到pSKihpTHCA；六、胶回收获得含有正反向THCA合成酶基因和内含子的片段，与经Sal Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切pCAMBIAsuper1300+植物表达载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定，Sal Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切进一步鉴定，植物表达载体pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA构建成功。