[发明专利]一种鸭坦布苏病毒冻干高免卵黄抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒冻干高免卵黄抗体的制备方法，所述的方法包括以下步骤(1)免疫用鸭坦布苏病毒病灭活苗的制备；(2)蛋鸡的免疫；(3)高免卵黄抗体的制备；3.1高免蛋的处理；3.2分离卵黄；3.3卵黄抗体IgY的分离；3.4卵黄抗体IgY的纯化；3.5冻干。本发明制备的鸭坦布苏病毒冻干高免卵黄抗体对于鸭坦布苏病毒病具有非常好的预防和治疗效果，并且具有成本低、产量高、质量稳定、高效、副作用小、无残留、易于保存、运输方便等优点。

主权项

一种鸭坦布苏病毒冻干高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：(1)免疫用鸭坦布苏病毒病灭活苗的制备：将鸭坦布苏病毒用灭菌生理盐水进行50‑100倍稀释后，尿囊腔接种9‑10日龄SPF鸡胚增值培养，收获48‑96h死亡的鸡胚尿囊液，经甲醛溶液灭活后作为水相与佐剂制成油乳剂灭活苗，4℃保存备用；(2)蛋鸡的免疫：选择健康的90日龄产蛋鸡，隔离饲养观察l周后无特殊反应者方可免疫，首免：每只鸡肌肉注射灭活苗lml，间隔14日后进行第二次免疫，每只鸡1.5ml，间隔14日进行第三次加强免疫，每只鸡2ml；7‑14日后用琼脂扩散方法测定卵黄抗体效价，达到1：64以上，即可收集高免蛋；(3)高免卵黄抗体的制备：3.1高免蛋的处理：高免蛋用0.1％新洁尔灭溶液浸泡15min，洗涤干净，放入无菌室晾干备用；3.2分离卵黄：无菌操作，打破蛋壳，分离蛋清与蛋黄，充分除去蛋清和蛋黄系膜，收集的蛋黄置于无菌容器中，搅拌均匀；3.3卵黄抗体IgY的分离：将卵黄原液用蒸馏水进行1:9倍稀释，混匀，用稀酸调PH值至5.3，静置；8000r/min离心30min，取上清液，缓慢加入1％正辛酸，搅拌10min，放入冰箱冷冻10min，抽滤，即得IgY初提液；3.4卵黄抗体IgY的纯化：分别将50％饱和硫酸铵溶液和步骤3.3得到的IgY初提液的PH值调节为5.3；在IgY初提液中缓慢加入相同体积的50％饱和硫酸铵溶液，4℃过夜；离心弃去上清液后，用0.8％PBS重新悬浮沉淀至初体积，在搅拌的同时加入初体积一半的33％的饱和硫酸铵溶液，静置1h，再次离心，弃去上清液；用0.8％PBS重悬沉淀，即得纯化后的IgY溶液；3.5冻干：将检验合格的IgY溶液加入稳定剂，并按每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，充分摇匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥。