[发明专利]表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法

摘要

表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，涉及基因重组人类血清白蛋白在黑麦草基因组中的整合以及转基因植株的筛选。目的是解决目前人血清白蛋白来源有限切价格昂贵的问题。方法一、以黑麦草成熟胚为外植体诱导愈伤组织；二、菌液的活化与重悬；三、将愈伤组织浸泡于农杆菌重悬液；四、将浸泡后的愈伤组织转入培养基上共培养；五、将愈伤组织转入筛选分化培养基中培养，诱导出抗性再生植物，鉴定为阳性的即为转基因黑麦草。本发明用于制备表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草。

主权项

利用转基因黑麦草表达人血清白蛋白的方法，其特征在于植物基因组中整合了人类血清白蛋白基因的转基因黑麦草的制备和筛选方法，按以下步骤进行：（一）将黑麦草种子置于50% H2SO4浸泡处理20‑30分钟去皮，纯水漂洗3‑5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；（二）选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75%的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30%(v/v)次氯酸钠溶液消毒5‑10min，无菌水冲洗5‑6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；（三）两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；（四）将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50‑1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6‑0.8，获得活化菌液；（五）取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5‑0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10‑20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24‑26℃黑暗条件下共培养3d；（六）将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L 羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。