[发明专利]一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法

摘要

本发明涉及一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法：以巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒作为增强基底，核酸适配体通过静电吸附作用吸附在巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒表面，从而保护金纳米棒颗粒在盐溶液环境下不发生聚集现象，然而，当核酸适配体互补DNA与食源性致病菌共同存在时，由于互补DNA与食源性致病菌竞争性地与核酸适配体发生特异性结合，导致适配体构象严重变化，进而导致巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒在盐溶液中的聚集差异；通过自主搭建的显微拉曼光谱系统，测定上述混合溶液拉曼信号，得到不同浓度食源性致病菌存在时巯基苯胺染料的拉曼图谱，实现对食源性致病菌的定量检测，并在牛奶实际样品中进行方法可行性验证。

主权项

1.一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)食源性致病菌样本准备：首先将微生物的菌株分别接于Luria‑Bertani培养基中于37℃培养24h，然后以转速5000g离心5min，弃上清液，并用超纯水清洗三次，分别重新分散于超纯水，最后将所获得的细菌菌液分别进行10倍梯度稀释，获得8个梯度的菌液储存备用，同时采用菌落平板计数法分别确定细菌具体的菌落数量；2)增强基底制备：增强基底金纳米棒的合成是利用种子生长法，在十六烷基三甲基溴化铵CTAB胶束水溶液中加入硝酸银；混合物反应20min，直到颜色变成红葡萄酒；随后，将硫酸钠加入至混合溶液中进行进一步生长；最终，将硫化处理后的金纳米棒收集离心，用纯水洗三次，最后分散在超纯水中；取对巯基苯胺与1mL制备金纳米棒混合，连续震荡反应5h，得到以对巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒增强基底；3)拉曼光谱采集：首先，将优化后100μL 20mM氯化钠溶液及100μL 20mM核酸适配体溶液加入到上述制备的80μL对巯基苯胺修饰的金纳米棒混合物中；随后将150μL核酸适配体互补DNA与不同浓度食源性致病菌依次分别加入至相同体积上述混合溶液中，37℃连续震荡反应3h，最终，分别取检测体系溶液300μL于96孔板中，利用所搭建显微拉曼光谱系统在800‑930nm波长范围内进行拉曼光谱测定，在此，拉曼光谱的激光波长设定为785nm；4)牛奶中食源性致病菌加标回收检测：利用加标回收结合对巯基苯胺修饰金纳米棒的检测方法实现液态牛奶样本中的食源性致病菌的检测；检测前需要对样本进行预处理；首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液；最后采用步骤3)设计的方法检测牛奶样本中的食源性致病菌浓度，并与所添加的浓度作对比。