[发明专利]一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法有效
| 申请号： | 201611097658.4 | 申请日： | 2016-12-02 |
| 公开（公告）号： | CN106754872B | 公开（公告）日： | 2019-07-05 |
| 发明（设计）人： | 杜克兵;余晓莉;胡兴宜;荣新军;仝瑞冠;李立志 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学;湖北省林业科学研究院 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京精金石知识产权代理有限公司 11470 | 代理人： | 强红刚 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，该方法将CTAB法和SDS法进行了结合，并优化各步骤技术参数，使得本方法提取得到的基因组DNA具有浓度高、无污染的优点，用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于标准值，完全能满足后期采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组测序(Metagenomics)的要求，可直接应用于分子操作。 | ||
| 搜索关键词： | 微生物基因组DNA 杨树木材 测序 分光光度计 基因组DNA 方法提取 分子操作 宏基因组 技术参数 优化 应用 | ||
【主权项】：
1.一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA 的方法，该方法包含下述步骤：（1）收集杨树湿心材或健康边材样本，经液氮研磨后加入活性炭及提取缓冲液，再加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠，混匀；所述的提取缓冲液包含下列组分：1%CTAB+2%PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M 磷酸钠缓冲液pH8.0，蛋白酶K浓度为20mg/ml，十二烷基硫酸钠的质量浓度为10%；（2）放入58～62℃水浴1.5～3h，期间颠倒混匀3～4次，然后进行第一次离心，转移第一次离心后的上层水相；（3）向所述第一次离心后的水相中加入1/2体积的PEG6000，混匀静置后进行第二次离心，去掉第二次离心后的上层水相；（4）向所述第二次离心后的沉淀中加入TE和醋酸钾，混匀静置后进行第三次离心，转移第三次离心后的上层水相；（5）向所述第三次离心后的水相中加入等体积的苯酚‑氯仿‑异戊醇溶液，混匀静置后进行第四次离心，转移第四次离心后的上层水相；苯酚‑氯仿‑异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为 25：24：1；（6）向所述第四次离心后的上层水相中加入0.6‑0.8倍体积的异丙醇，混匀室温静置0.5‑1.5h后进行第五次离心，收集沉淀；（7）向所述第五次离心后收集到的沉淀先后采用75%酒精、无水酒精洗涤，然后进行第六次离心得到DNA沉淀，使用TE溶解DNA沉淀，再加入RNase A，水浴后得到所提取的微生物基因组DNA。
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