[发明专利]一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物及其应用有效
| 申请号： | 201611084388.3 | 申请日： | 2016-11-30 |
| 公开（公告）号： | CN106381341B | 公开（公告）日： | 2020-01-17 |
| 发明（设计）人： | 兰成忠;吴玮;阮宏椿;姚锦爱 | 申请（专利权）人： | 福建省农业科学院植物保护研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645 |
| 代理公司： | 11465 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 350013 福建省福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种芋疫霉菌（ | ||
| 搜索关键词： | 一种 霉菌 pcr 检测 引物 及其 应用 | ||
【主权项】：
1.一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：/n(1)提取待测样品基因组DNA；/n(2)巢式PCR第1轮扩增：所用引物为：/nph1F：5′-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3′，/nYph2R：5′-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3′；/n以步骤(1)提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物对ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增；/nPCR反应体系25L：2×TaqPCRMasterMix12.5L，10mol/L的ph1F/Yph2R引物各1.0L，DNA模板1.0L，用无菌超纯水补足至25L；/nPCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火30S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min；/n(3)巢式PCR第2轮PCR扩增：所用引物对为：/nPCOF：5′-AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA-3′，/nPCOR：5′-AATCTCATGCAGCCACTGCT-3′，/n待步骤(2)第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl第一轮PCR扩增产物稀释1-100倍为模板；/nPCR反应体系25L：2×TaqPCRMasterMix12.5L，10mol/L的PCOF/PCOR引物各1.0L，DNA模板1.0L，用无菌超纯水补足至25L；/nPCR条件为：扩增参数为95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min；/n(4)凝胶电泳检测：取5.0L步骤(3)第2轮PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出327bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在芋疫霉菌；若无特异性条带则说明样品中无芋疫霉菌。/n
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