[发明专利]一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法

摘要

本发明公开了一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，对鲳鲹进行解剖并分离得到其头肾的巨噬细胞，通过Percoll溶液密度梯度离心方法，提取头肾的巨噬细胞。通过台盼蓝染色的方法对其体外培养的细胞存活数量进行计数，并且检测其一周内的存活状况。通过吞噬实验，测定卵形鲳鯵头肾巨噬细胞对鰤鱼诺卡氏菌和酵母等的吞噬情况，以观察其吞噬功能。通过实验结果可以发现，本发明能够良好地提取鲳鲹巨噬细胞，并能够良好地观察鲳鲹巨噬细胞的存活情况与吞噬情况。本发明为进一步研究鲳鲹巨噬细胞的生理学、病理学、毒理学奠定了基础。

主权项

1.一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的：1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片，并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域，所述圆形区域的直径为1.5cm；2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域，所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl，所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml；3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25℃条件下培养1‑2小时；4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后，用25℃左右的L‑15洗涤所述载玻片；5).将50μl微生物细胞悬液加入所述圆形区域，巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例；6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min；7).用磷酸盐缓冲液或L‑15洗所述载玻片5次；8).用100μl 100％甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min，用70％甲醇冲洗所述载玻片5次；9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片；10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况；其中，所述鲳鲹巨噬细胞是按照下面的步骤制备的：a.解剖鲳鲹，取出头肾；b.将所述头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上，该细胞筛下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5ml L‑15培养基的培养皿；c.将所述培养皿放置冰块上，在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾，使所述头肾细胞落入所述含L‑15的培养皿中形成鲳鯵细胞悬液；d.将细胞悬液贴壁轻柔的转移到Percoll梯度离心管的34％Percoll层之上；e.移动加样完毕的所述Percoll梯度离心管，于4℃，400g，离心25分钟；f.用无菌吸管小心吸取并弃去所述Percoll梯度离心管的上层34％Percoll液体，再用无菌吸管吸取临近34％Percoll/51％Percoll界面处的细胞悬液层，即得到鲳鲹头肾巨噬细胞；g.加入1ml L‑15到所述鲳鲹头肾巨噬细胞悬液，然后在4℃，2000rpm条件下离心7min，弃上清；h.取沉淀加入1ml灭菌双蒸水冲洗所述鲳鲹头肾巨噬细胞15‑30s，4℃，2000rpm离心7min，弃上清；步骤h所获得的所述鲳鲹巨噬细胞进行如下步骤的培养：A.用L‑15培养基重悬所述鲳鲹巨噬细胞沉淀形成巨噬细胞悬液后用血球计数板，显微镜观察，计数所述鲳鲹巨噬细胞；B.根据鲳鲹巨噬细胞计数结果用L‑15培养基调整所述鲳鲹巨噬细胞浓度为1×107细胞/ml，用含钾青霉素/链霉素硫酸盐的无血清L‑15培养液进行稀释，其中钾青霉素/链霉素硫酸盐用量:每100ml L‑15培养基中青霉素和链霉素各100i.u；C.将所述巨噬细胞悬液转入细胞培养板或细胞瓶，无血清L‑15培养液中25℃培养2h；D.待头所述肾巨噬细胞贴壁后，吸弃无血清L‑15培养液，加入含10％小牛血清、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L‑15培养液，继续培养。