[发明专利]导致CD36缺失的CD36突变基因真核稳定表达细胞株的建立方法

摘要

本发明提供了导致CD36缺失的CD36突变基因真核稳定表达细胞株的建立方法，包括从CD36缺失个体提取总RNA并反转录获取CD36变异基因开放阅读框全段的CD36 cDNA；建立包含CD36变异基因 cDNA和EGFP荧光报告基因的重组克隆载体，并转化到大肠杆菌做质粒扩增与鉴定；将重组克隆载体转染CHO‑K1细胞，筛选和鉴定获得CD36突变基因真核稳定表达细胞株的全过程。CD36分布于多种细胞和组织，编码CD36的基因变异，能导致个体出现CD36缺失。CD36在多种生理病理过程中有重要作用，涉及到血小板同种免疫、高胆固醇血症、糖尿病、疟疾等疾病。使用本技术建立的CD36突变基因真核稳定表达细胞株，可为研究CD36的结构和功能，阐明所参与的生理和病理机制，探讨在临床治疗中角色和药物研发，提供资源和工作平台。

主权项

一种导致CD36缺失的CD36突变基因真核稳定表达细胞株的建立方法，该方法的特征包括：①首先从CD36缺失个体全血标本提取总RNA，由一对PCR扩增引物对CD36mRNA蛋白编码区进行反转录PCR扩增，获取导致CD36缺失的CD36突变基因cDNA序列片段，所述的反转录PCR扩增引物包括上游引物YC‑36F和下游引物YC‑36R，其中，上游引物YC‑36F的序列为：5’‑ATC CTC GAG ATG GGC TGT GAC CGG A‑3’，下游引物YC‑36R的序列为：5’‑GCA GAA TTC GTT TTA TTG TTT TCG ATC‑3’；②通过四条正向和反向引物，使用重叠延伸PCR技术，该技术英文全称为gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE‑PCR，拼接扩增CD36突变基因和EGFP荧光基因，获取包含CD36突变基因cDNA编码区全段、EGFP荧光基因全段和所需酶切位点的突变基因序列片段MT‑CD36‑EGFP；所述SOE‑PCR引物包括：扩增获取包含EcoR 1酶切位点及保护碱基、CD36蛋白编码区全段的基因序列、融合蛋白基因BamH I及保护碱基、荧光报告基因EGFP首端部分序列的目的基因片段MT‑CD36‑EGFP‑1的正向引物CD36‑F2和反向引物CD36‑R3，且正向引物CD36‑F2亦为后续SOE‑PCR拼接扩增MT‑CD36‑EGFP的正向引物，其序列为：5’‑CCG GAA TTC ATG GGC TGT GAC CGG AAC T‑3’，反向引物CD36‑R3为：5’‑TGC TCA CCA TGG ATC CGC GTT TTA TTG TTT TCG ATC TGC‑3’；扩增获取包含部分CD36编码区cDNA片段尾端片段、融合蛋白基因BamH I及保护碱基、荧光报告基因EGFP全段的基因序列、XhoI酶切位点及保护碱基的目的基因片段MT‑CD36‑EGFP‑2的正向引物EGFP‑F4和反向引物EGFP‑R2，且该反向引物EGFP‑R2亦为后续SOE‑PCR拼接扩增MT‑CD36‑EGFP的反向引物，其正向引物EGFP‑F4的序列为：5’‑AAC AAT AAA ACG CGG ATC CAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA‑3’，反向引物EGFP‑R2的序列为：5’‑CCG CTC GAG CCG CTT TAC TTG TAC AGC TCG T‑3’；③将MT‑CD36‑EGFP连接至pLV4/StripII‑HIS10载体，构建和扩增制备包含CD36突变基因和EGFP荧光基因的MT‑CD36‑EGFP‑pLV4/StripII‑HIS10真核表达载体；④应用病毒介导的真核转染技术，将成功构建的MT‑CD36‑EGFP‑pLV4/StripII‑HIS10真核表达载体，转染入CHO‑K1细胞系，筛选和建立导致CD36缺失的CD36基因突变真核稳定表达细胞株MT‑CD36‑CHO‑K1；⑤应用所发明的相同方法，建立正常CD36基因真核稳定表达细胞株Normal‑CD36‑CHO‑K1作为实验的阳性对照，建立单纯稳定表达EGFP荧光蛋白的EGFP‑pLV4‑CHO‑K1株作为实验的阴性对照；在阴性对照EGFP‑pLV4‑CHO‑K1株的构建过程中，首先由1对PCR引物扩增获取包含EcoR 1酶切位点及保护碱基、荧光报告基因EGFP全段的基因序列、XhoI酶切位点及保护碱基的目的基因片段EGFP，所述PCR引物包括上游引物EGFP‑F3和下游引物EGFP‑R2，其上游EGFP‑F3的序列为5’‑CCG GAA TTC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GA‑3’，下游引物EGFP‑R2既是本权利要求中②所描述的MT‑CD36‑EGFP‑2片段的反向引物。