[发明专利]一种稳定表达抑癌基因REIC/Dkk3的人脐带间充质干细胞及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种表达抑癌基因REIC/Dkk‑3的人脐带间充质干细胞及其构建方法，根据GeneBank已有的REIC/Dkk‑3的基因序列，经聚合酶链式反应(PCR)合成得到REIC/Dkk‑3的基因片段，酶切载体GV208，建立PCR产物的线性表达载体，进一步转化并抽提质粒。按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染包装细胞293T细胞，提取病毒上清液并浓缩纯化后感染人脐带间充质肝细胞，持续培养使其稳定表达抑癌基因REIC/Dkk‑3。本发明得到的人脐带间充质干细胞具有间充质干细胞和抑癌基因REIC/Dkk‑3的双重效果，能够对肿瘤有效的靶向趋化，治疗膀胱肿瘤。

主权项

一种稳定表达抑癌基因REIC/Dkk‑3的人脐带间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述方法利用携带REIC/Dkk‑3的慢病毒感染人脐带间充质干细胞，使人脐带间充质干细胞持续稳定表达REIC/Dkk‑3，具体包括如下步骤：(1)表达REIC/Dkk‑3的慢病毒载体构建：根据GeneBank已有的REIC/Dkk‑3的基因序列，设计扩增引物，提取总RNA，经聚合酶链式反应PCR合成得到REIC/Dkk‑3的基因片段，酶切载体GV208，建立PCR产物线性表达载体，进一步转化抽提质粒，共转染包装细胞293T细胞，出现强绿色荧光并有细胞融合现象时，收集含慢病毒颗粒的细胞上清液，并测定病毒滴度；(2)人脐带间充质干细胞的培养：取足月正常妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，以PBS充分洗涤，剔除脐动、静脉，以α‑MEM原代培养人脐带间充质干细胞，对分离培养的细胞进行表型鉴定，并置37℃、5％CO2，饱和湿度培养箱，待细胞80％融合时，胰酶消化1:3传代，连续培养至3代后采用流式细胞学技术检测细胞表面标志物；(3)重组慢病毒转染人脐带间充质干细胞及鉴定：将携带REIC/Dkk‑3基因的重组慢病毒转染入人脐带间充质干细胞，通过实时定量PCR及蛋白质印迹检测法检测REIC/Dkk‑3表达情况，使人脐带间充质干细胞持续稳定表达REIC/Dkk‑3，并用GFP标记。