[发明专利]一种基于精浆代谢组学的OPLS-DA诊断模型的建立方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于精浆代谢组学的OPLS‑DA诊断模型的建立方法及其应用，包括如下步骤：筛选建模对象和样品采集；制作质量控制样本；样品提取；样品衍生化；色谱—质谱分析；质量控制样品的使用；化合物的鉴定；OPLS‑DA建模。该种基于精浆代谢组学的OPLS‑DA诊断模型，该模型对UMI的判别效果优于使用精液参数中的精液量、精子密度、精子活率、精子活力以及精子运动方式等参数建立的OPLS‑DA模型，前者的灵敏性和特异性分别为98％和95％，后者的灵敏性和特异性仅为67％和73％。

主权项

1.一种基于精浆代谢组学的OPLS‑DA诊断模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选建模对象和样品采集：分别选取不明原因不孕不育男性病例组和生殖功能正常男性对照组，按照WHO标准的方法进行精液样本采集，并将精浆分离保存在‑80℃冰箱内冷冻为样品；(2)制作质量控制样本：对每个参与分析的样品取5μL混合，制成质量控制样品，分别取25μL质量控制样品置于不同的1.5mL离心管中，‑80℃保存；(3)样品提取：将样品在室温下放置30min融化后，吸取25μL样品于1.5mL的离心管中，将上述质量控制样品融化，样品与质量控制样品均加入内标0.3mg/mL的氯苯丙氨酸和1mg/mL的十七烷酸共混液10μL混匀，再加入有机溶剂300μL，漩涡振荡30s得混合液，将混合液置于‑20℃沉淀10min，然后在加速度为10,000g下离心10min，分别吸取上清300μL于进样瓶中，在室温下将其真空干燥；(4)样品衍生化：上述进样瓶经抽干后，加入15mg/mL甲氧胺吡啶80μL，振荡30秒，于30℃下反应90分钟，然后再加入80μLBSTFA70℃反应60分钟；(5)色谱—质谱分析：将样品与质量控制样品按照每10个样品为一个批次插入1个质量控制样品通过气相色谱－质谱联用仪进行分析；(6)质量控制样品的使用：计算全部质量控制样品中内标的RSD，该RSD要求小于0.3，如果不符合要求，则将变动过大的批次的样本重新分析；如果符合要求，则根据内标峰面积建立质控图，以mean±2SD作为警告限，以mean±3SD作为控制限，连续两次超出警告限、超出控制限一次、连续5次升高或者降低就算失控，失控后样品批次需要重新分析；由于每个待测样品中都包含内标，对样品中内标超出控制限的数据认定无效数据处理；(7)化合物的鉴定：使用Chromatof软件对谱峰进行去卷积处理以获得物质的质谱图并根据该质谱图进行谱库搜索，根据保留时间和谱库匹配度进行定性，经峰判断后得到保留时间、含未鉴定物质的物质名称和峰面积，对每个样品进行数据处理后，获得每个样品所包含的每个物质的峰面积，根据物质的鉴定情况，对样本和检测出的物质进行整合，形成行为样品中物质组成的响应强度，列为物质在样品中的响应强度的矩阵表，将上述经过处理的矩阵表导入到SIMCA‑P11.5软件包用于多维统计，数据在SIMCA‑P软件中进行中心化和pareto均一化处理，即是将各个谱峰的峰面积进行开平方处理，以减少峰面积大的谱峰带来的偏差；(8)OPLS‑DA建模：将步骤(7)中多维数据在压缩前先按照需要寻找的差异因素分组，以找到与用于分组的因素最相关的变量和屏蔽其它的影响因素，在建模之前，预先设定一个Y值，用来提取代谢物矩阵中与Y值最相关的数据信息，将上述对照组样品的Y值设定为O，病例组样品的Y值设定为1，建立OPLS‑DA模型，找到伴随模型贡献较大的代谢物变量，并通过这些代谢物变量的联合使用建立诊断模型。