[发明专利]基于多功能化二硫化钼的miRNA-21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了基于多功能化二硫化钼的miRNA‑21电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括将制备的Fe3O4磁性纳米颗粒进行氨基化，然后与氯金酸反应制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的步骤；将制备的单片层MoS2进行羧基化，后依次与偶联试剂、信号DNA溶液和鲁米诺溶液反应，最后加入巯基己醇溶液震荡清洗得到信号单元溶液的步骤；将Fe3O4@Au与捕获DNA溶液反应得到捕获单元溶液的步骤；最后将捕获单元溶液滴涂于磁性玻碳电极表面，然后依次将miRNA‑21、信号单元溶液滴涂于磁性玻碳电极表面即可，优点是灵敏度高，特异性强、准确性高以及操作步骤简单，实验成本低。

主权项

一种基于多功能化二硫化钼的miRNA‑21电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的制备a.制备Fe3O4磁性纳米颗粒：将0.7～1.0g FeCl3·6H2O和0.2～0.5g FeCl2·4H2O溶于50～100mL的二次水后加入到三口烧瓶中，通氮气，磁力搅拌混合均匀，温度升高到80～100℃，向三口烧瓶中缓慢滴加20～25wt％的氨水，调节pH＝9～10，继续加热搅拌1～2h后，停止加热，在氮气的保护下，搅拌回流，冷却至室温，制备得到的黑色沉淀物即为Fe3O4磁性纳米颗粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50mL；b.制备氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒：将步骤a所制备的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1h，加入0.2～0.3mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5h，加入1～2mL 0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h后，得到氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100mL；c.制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒：将5～10mL步骤b所制备的氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20mL 1wt％HAuCl4在60～100kHz的超声频率下混合，搅拌1h后，缓慢加入30～50mL 20～30mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3h，得到Fe3O4@Au磁性纳米颗粒，二次水清洗，定容至20mL；(2)信号单元的合成a.制备单片层MoS2：称取0.8～1g MoS2粉末加入高压釜，随后加入30～35mL 0.4～0.5mol/L的正丁基锂正己烷溶液，将高压釜密封后放在100℃真空干燥箱中反应4～5h，获得的产物过滤洗涤，在60℃真空烘箱中干燥得到锂离子插层的二硫化钼；取0.1～0.2g锂离子插层的二硫化钼分散在200～300mL水中，室温下超声4～5h，得到单分子层的MoS2水溶液，冷冻干燥后得到MoS2粉末；b.制备羧基化MoS2：将0.04～0.05g步骤a所制备的MoS2粉末加入到40～50mL 30～40mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超声仪中超声2～3h，低速离心除去未完全剥离的MoS2，最终获得羧基化的MoS2纳米片层；c.合成信号单元：取100～200μL 1～2mg/mL羧基化的MoS2纳米片层溶液超声1h，加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，用0.5～1.0mol/L盐酸调节溶液pH为4～6，常温震荡30～40min，离心洗涤去除上清液，取沉淀定容至200～300μL；加入20～30μL 1～5μmol/L信号DNA溶液和20～30μL 0.05～0.1mol/L鲁米诺溶液，用1～2mol/L氢氧化钠调节溶液pH为9～10，混合均匀，常温震荡3～4h；最后加入10～20μL 10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，继续震荡1～2h，用二次水清洗离心去除上清液，最后将沉淀分散在杂交缓冲液中定容至30～50μL，即得到信号单元溶液；(3)捕获单元的合成取50～100μL Fe3O4@Au溶液超声5～10min，加入20～50μL 1～5μmol/L捕获DNA溶液，用DNA固定缓冲液定容至200μL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h；然后滴加10～20μL 10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，用水清洗离心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100μL，即得到捕获单元溶液，4℃下保存备用；(4)电化学发光免疫传感器组装a.将直径为3～5mm磁性玻碳电极依次用0.1、0.3、0.05μmol/L Al2O3浆抛光成镜面，依次用无水乙醇、蒸馏水超声波清洗，N2吹干；b.取5～10μL捕获单元溶液滴涂于上述预处理过的磁性玻碳电极表面，通过磁性作用，捕获单元即被牢固地吸附在电极表面，然后将5～10μL miRNA‑21溶液滴涂在电化学发光免疫传感器上，置于37℃中孵育1～2h，清洗；再取5～10μL步骤(2)所得的信号单元溶液，置于37℃中孵育1～2h后，清洗得到基于多功能化二硫化钼的miRNA‑21电化学发光免疫传感器。