[发明专利]一种静注人免疫球蛋白Fc段活性检测方法

摘要

本发明公开了一种静注人免疫球蛋白Fc段活性检测方法，采用更易获得的稳定抗原，添加系统适用性验证，采用细胞计数法直观的检测红细胞溶血，降低传统OD值间接检测时样本澄明度、杂蛋白、试剂、设备耗材等造成的结果波动，提高检测结果的精密度。同时缩小检测体系、提高通量，操作更为便捷。

主权项

1.一种静注人免疫球蛋白Fc段活性检测方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)取90μl标准品和样品，加入10μl抗原敏化红细胞，吸打混匀；(2)37℃水浴30min，以1000g离心力在10℃离心10min，使用200μl/管牛白蛋白‑巴比妥缓冲液洗涤两次，最后一次洗涤吸取并废弃上清，尽量吸取完全；(3)加入80μl预热至37℃的牛白蛋白‑巴比妥缓冲液，加入20μl补体，吸打混匀，操作尽量轻柔并确保细胞吹散；(4)迅速加入细胞计数板中，读数，每间隔1min读取细胞总数一次；(5)数据处理：计算公式如下：S’＝Sexp/As     (a)IFc＝100％×[(Ss’‑Sc’)/(Sr’‑Sc’)]    (b)公式中：S’为用As修正Sexp得到的总细胞数最大差值；As分别为样品、标准品及阴性对照的起始细胞总数；Sexp分别为根据样品、标准品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的总细胞数最大差值；IFc为样品激活补体的功能指数；Ss’为样品总细胞数最大差值；Sc’为阴性对照总细胞数最大差值；Sr’为标准品总细胞数最大差值；按公式(a)分别计算出标准品、样品和阴性对照总细胞数最大差值；按公式(b)计算样品激活补体的功能指数(IFc)；敏化红细胞所用抗原为重组风疹抗原E1或重组白喉CRM197；敏化红细胞的制备步骤具体为：①O型血红细胞用PBS缓冲液洗涤三次；②用PBS缓冲液配制为2％红细胞悬液；③鞣化红细胞：2％红细胞悬液按1:1的体积比加入1.3mg/L鞣酸B液混匀，37℃水浴15min；④PBS缓冲液洗涤③中鞣化红细胞一次，并用PBS缓冲液将鞣化红细胞稀释为1％；⑤每100μl 1％鞣化红细胞悬液中加入抗原0.02mg，37℃水浴30min；⑥牛白蛋白‑巴比妥缓冲液洗涤⑤制备的红细胞两次；⑦牛白蛋白‑巴比妥缓冲液调整⑥洗涤后红细胞浓度为1％～1.5％，稀释10倍后，细胞计数总细胞数为2500±500个；至此，敏化红细胞制备完成；质控品溶液的制备：牛白蛋白‑巴比妥缓冲液稀释IFc％＝100％的标准品至40g/L，稀释后标准品与蛋白浓度为40g/L的F(ab’)2片段溶液按1:1比例混合；质控品溶液的标定：新鲜标准品标定质控品IFc％10次，取平均值为质控品溶液IFc％值，标定后IFc％＝48.31％；标准品：复溶后新鲜标准品加牛白蛋白‑巴比妥缓冲液，所述复溶后新鲜标准品pH＝6.0～7.0，调节蛋白浓度为40g/L，4℃保存；样品pH＝7.0，蛋白浓度40g/L；鞣酸A液：取1mg鞣酸，用10ml pH7.2的PBS缓冲液溶解；1.3mg/L鞣酸B液的制备为：取A液0.1ml，用7.5ml pH7.2的PBS缓冲液溶解。