[发明专利]一种高生防力葡萄灰霉菌拮抗菌的快速诱抗筛选方法

摘要

本发明公开了一种高生防力葡萄拮抗菌的快速诱抗筛选方法，该方法采用灭活的葡萄灰霉菌菌丝体粉末、几丁质、壳聚糖、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等做为菌株拮抗代谢物诱抗剂加入培养基；采用培养3～4天浓度10⁴cfu/mL的灰霉孢子液对着长平板快速喷雾灰霉菌孢子液，1h后倒置放于28℃恒温共培养48h‑72h，观察其生长情况；并通过滤纸片法复筛确定拮抗菌的拮抗性。本发明提供一种葡萄高生防力灰霉菌拮抗菌的快速诱抗筛选方法，适于葡萄等果蔬灰霉菌高效稳定拮抗菌的筛选，操作较传统方法简单、快速、筛选效率高，为葡萄采后灰霉菌的生物防治奠定基础，提供可靠的技术与理论依据。

主权项

1.一种葡萄灰霉菌拮抗菌的快速诱抗筛选方法，其特征在于：步骤如下：/n⑴将有机械伤口的葡萄于无菌水中震荡混匀后稀释不同浓度，不同稀释度的稀释液分别涂布于含有2-5wt％灭活的葡萄灰霉菌菌丝体粉末、0.5-lwt％几丁质、0.5-lwt％的壳聚糖和0.05-0.1wt％的Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺盐的PDA培养基平板上，每个稀释液重复两次，将涂布好的培养皿倒置放于28℃条件下培养48h，挑选涂布培养后长有拮抗菌的平板备用；/n⑵将步骤⑴中剩余的没有挑取的灰霉菌PDA平板于培养5-7d至大量孢子产生后，用0.5wt％吐温-80洗下灰霉菌病原孢子，获得灰霉孢子液，血球计数板调节孢子液中孢子的浓度为10⁴cfu/mL；/n⑶在浓度调节好的灰霉孢子液中按照0.1-0.3wt％的比例加入N-乙酰葡萄糖和几丁寡糖，对着步骤⑴中挑选的长有拮抗菌的平板快速喷雾一次，喷雾浓度为10⁴cfu/mL灰霉菌孢子液，1h后倒置放于28℃恒温培养48h-72h，观察共培养后的抑菌圈大小，根据抑菌圈的大小筛选拮抗菌，抑菌圈大小为抑菌圈外径减扣去培养的拮抗菌的半径，抑菌圈越大说明拮抗效果越好；/n⑷把具有抑菌圈的菌在营养培养基平板上进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状，即为纯化好的拮抗菌；/n⑸复筛：将纯化好的拮抗菌点种于营养培养基平板上，28℃培养箱内培养48h后，喷灰霉菌孢子液后28℃培养箱内继续培养48h，观察有稳定抑菌圈的为灰霉菌拮抗菌；/n所述营养培养基为麦芽汁琼脂培养基或NYDA固体培养基；NYDA液体培养基的配方为:营养肉汤8g，酵母膏5.0g，葡萄糖10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min；/n所述PDA培养基为PDA液体培养基或PDA固体培养基；PDA液体培养基的配方为:马铃薯300g，葡萄糖20g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000mL，在PDA液体培养基中加入琼脂20g形成PDA固体培养基。/n