[发明专利]联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法

摘要

本发明公开了一种联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法，该方法包括以下步骤：1)将外周血单个核细胞加入细胞培养基中，预活化其中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞，再选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞；2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得混合细胞。该方法使用健康供者的γδT可以进行标准化和批量化制备；另外本申请中Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的纯度无需纯化即可分别达到60％和30％以上，因此可以避免预先纯化；使用该方法联合制备的CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞可通过临床用药来控制其在体内的活化增殖程度及存续时间。

主权项

1.一种联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞；将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，再加入抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物预活化PBMC中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞，之后再加入rhIL‑2或rhIL‑15进行Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增；2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞，即得包含CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的混合细胞，其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合；其中，步骤1)中，使用的抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物加入细胞培养基后的浓度为1‑10μM；所述含氮二膦酸盐类药物为帕米膦酸二钠；所述预活化、选择性体外活化扩增的条件均为在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行；在预活化12‑36h后加入rhIL‑2或rhIL‑15，选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞7天以上；步骤2)中，携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞的具体步骤为：收集包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞，调整包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞的浓度至5×106个/ml，携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体和混合细胞以1:4的体积比混合静置6‑12h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜无血清细胞培养基保持72小时。