[发明专利]联合制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的方法

摘要

本发明公开了一种联合制备CAR‑NK细胞和CAR‑NKT细胞的方法，该方法包括以下步骤：1)将外周血单个核细胞加入细胞培养基中，预活化其中的NK细胞和NKT细胞，再选择性体外活化扩增NK细胞和NKT细胞；2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得混合细胞。该方法使用健康供者的NK和NKT可以进行标准化和批量化制备；另外本申请中NK细胞和NKT细胞的纯度无需纯化即可分别达到60％和30％以上，因此可以避免预先纯化；使用该方法联合制备的CAR‑NK细胞和CAR‑NKT细胞可通过临床用药来控制其在体内的活化增殖程度及存续时间。

主权项

1.一种联合制备CAR‑NK细胞和CAR‑NKT细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）从健康供者的外周血中分离得到外周血单个核细胞（PBMC）；将所得外周血单个核细胞加入到含有10%血浆的无血清细胞培养基中，将细胞浓度用所述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，再全部转移到培养瓶中，所述培养瓶被20μg/ml的抗CD16单克隆抗体包被、或被10ng/ml的抗CD3单克隆抗体和10μg/ml的抗CD52单克隆抗体包被，使其在无血清细胞培养基的终浓度为1×105个/ml，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中进行外周血单个核细胞中的NK细胞和NKT细胞的预活化，预活化24h之后再加入IL‑2使其在无血清培养基中的浓度为1000U/ml、并加入IL‑15使其在无血清细胞培养基中的浓度为10ng/ml，继续于37℃、5%二氧化碳的培养箱中进行NK细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增，得到包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞；2）用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1）所得包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞，即得包含CAR‑NK细胞和CAR‑NKT细胞的混合细胞，其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合；其中，所述血浆与外周血单个核细胞来自于同一血液供体；所述靶向表面抗原为CD19；上述方法还包括对CAR19‑NK/NKT细胞的体外抗肿瘤活性进行试验验证的步骤：以转导后所得CAR19‑ NK /NKT细胞作为效应细胞，以表达CD19的Raji肿瘤细胞作为靶细胞进行杀伤试验验证，体外采用cytotox96试剂盒检测细胞杀伤效果，按照不同的效靶比，建立CAR‑NK/NKT细胞与靶向肿瘤细胞的共培养体系，检测培养基上清中由被裂解的肿瘤细胞释放的LDH含量，以此反应CAR‑NK/NKT细胞在体外杀伤肿瘤细胞的能力，当效靶比E:T=5：1时，对CD19+Raji细胞杀伤效率＞70%为合格。