[发明专利]一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌的基因转化方法。一种农杆菌介导的蝉拟青霉基因转化方法，包括以下步骤（1）制备蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae）的分生孢子；（2）将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；（3）将步骤（2）得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤（1）中恢复培养后的分生孢子混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；（4）确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子。

主权项

一种农杆菌介导的蝉拟青霉菌基因转化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在PDA培养基上23℃‑28℃培养蝉拟青霉菌5‑7天，使其大量产孢；（2）将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；用冻融法将质粒转化到农杆菌中：① 将农杆菌菌株AGL1在LB平板上划线活化，28℃培养2天；然后将1个单菌落转到5mL LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；② 将2mL上述培养液转移到装有50mL的 LB液体培养基的三角瓶中，28℃振荡培养6小时，测定其吸光度，当OD600 =0.5～1.0时停止培养；③ 将培养好的菌液放置在冰上，然后转移到50mL离心管中，在 4℃条件下，3 000g离心5min；④ 弃去上清液，沉淀用1mL预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮，分装到预冷的1.5 mL离心管中，每管0.1mL；⑤ 取4µL 的pTEGG质粒（0.25µg/µL）加入到含有0.1mL农杆菌的1.5 mL离心管中，盖好盖子，轻轻混匀，然后迅速放到液氮中冷冻；⑥ 取出1.5 mL离心管，置于37℃水浴中保温5min，解冻；⑦ 在1.5 mL离心管中加入1mL的 LB培养液， 28℃下，100rpm轻摇培养2～4h；⑧ 将离心管放入离心机中，12000rpm离心2min，弃去1mL培养液，然后将沉淀悬浮，涂布于含有50µg/mL卡那霉素的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2～4天；（3）将步骤（2）得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤（1）中培养得到的分生孢子混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；① 从新鲜培养的LB平板（含50µg/mL卡那霉素）上挑选农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基（含50µg/mL卡那霉素）中，200 r/min，28℃过夜培养；② 第二天，取400µL培养液转移到5mL含50g/mL卡那霉素的诱导液体培养基（AIM）中，OD600值约0.15，28℃培养5～6个小时，使菌液的OD600达到0.5～0.6；③同时将蝉拟青霉菌株PC‑1的分生孢子浓度调整好（107个/mL）；④ 将100mL的IM固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，卡那霉素储备液100µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成诱导平板；待培养皿中的培养基凝固后，将一张直径5cm的灭菌纤维素膜覆盖在培养基表面；⑤ 取100µL培养好的农杆菌AGL‑1（含载体）菌液和100µL转化材料混合，混合液均匀涂于诱导平板上的硝酸纤维素膜表面，22℃共培养48h；⑥ 将100mL的PDA固体培养基融化后，在室温冷却到50℃，然后加入乙酰丁香酮储备液200µL，头孢霉素储备液100µL，链霉素储备液100µL，卡那霉素储备液100µL，G418储备液350µL，轻轻摇动混匀后，倒入6cm一次性塑料培养皿中，制成筛选平板；将诱导平板上的硝酸纤维素膜切成约0.5cm的条带，转移到筛选平板上，条带之间相隔约0.5cm ，置于在28℃培养7天，可以见到有菌丝长到硝酸纤维素膜条带之间的培养基上；⑦ 挑取长出的菌丝，转移到含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，确认是否转化成功，如果能够生长，可确认转化成功；（4）确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子；1）从获得的转化子中随机挑选了6个转化子，在PDA培养基平板上28℃转接培养5次，然后再转接在含有360µg/mL的G418的PDA平板上，28℃培养5天，结果这6个转化子都可以生长，说明转化子的遗传稳定性好，转入的抗性基因稳定存在；2）绿色荧光检测将以上随机选择的6个转化子接种在PDA平板上，28℃培养5天；用挑针挑取少量菌丝，置于载玻片上，制成观察玻片，放到显微镜的载物台上；打开紫外光（450～490nm），观察绿色荧光；结果发现这6个转化子的菌丝都能发出绿色荧光，说明外源基因转化后可以进行稳定表达；3）PCR检测① 将随机挑选的6个转化子菌株在PDA平板上25oC生长7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300µL提取缓冲液的1.5mL离心管中；提取缓冲液：1M KCl, 100mM Tris‑HCl, 10mM EDTA，pH=8.0；② 用电磨机将挑取的菌丝磨碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2 min；③ 10000 rpm离心10min；④ 吸取上清至另一离心管中，弃沉淀；⑤ 加入等体积的异丙醇(分析纯)，沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心10min；⑥ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分；⑦ 加入300µL 70% 乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心2min；⑧ 轻轻倒去上清液，在吸水纸上吸干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；⑨ 用50µL ddH2O重悬沉淀，得到各转化子的基因组DNA，浓度达到30ng/µL；⑩以各转化子的基因组DNA为模板，分别利用引物Pgpd‑u/ G418d进行PCR扩增；PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行，其中，PCR反应体系（50µL）：上下游引物各2µM， dNTPs 200µM，Mg2+ 1.5mM，10 ×PCR buffer 5µL，模版DNA 2μL，Taq 酶2U；PCR反应条件：94℃ 预变性2min，然后35个循环包括：94℃ 变性30sec，60℃ 退火40sec，72℃ 延伸1.5 min；最后72℃ 后延伸10min；PCR反应结束后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现这6个转化子中都出现了约1.4kb的电泳条带，说明抗G418基因稳定整合到蝉拟青霉的基因组中。