[发明专利]一种口腔拭子核酸常温保存方法

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种口腔拭子核酸常温保存方法，包含了两步，第一步为检测待保存的口腔拭子核酸的质量，第二步为进行口腔拭子核酸的常温保存，在确保需要保存的核酸质量的前提下，对常温保存的多个限定条件进行实验，选定了保存的具体条件，本发明的优点为操作简单、考虑全面，控制了保存的温度区间及保存的时间长度，能更好地应用到实际情况中。

主权项

一种口腔拭子核酸常温保存方法，其特征在于，可以在25度至45度的常温下保存6个月，具体步骤如下：第一步，检测待保存的口腔拭子核酸的质量：口腔拭子核酸样品完整率和畸形率检测，先准备洁净的载波片，用洗涤灵擦洗，清水冲洗，再用蒸馏水漂洗，以不挂水珠为净，烘干或晾干备用，抹片：将需测定的样品摇匀，取滴中层样品平滴于载玻片的右端，取另一张边缘光滑平直的载玻片，呈35°角自口腔拭子核酸样品的左面向右接触样品，样品即呈条状分布在两个载玻片接触边缘之间，将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着样品均匀地分布在载玻片上，在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号，每份样品需同时制作两个抹片，自然风干5～20min。固定：将风干的抹片平置于染色架上，用滴管吸取1ml固定液，滴于抹片上，并使固定液布满于整个抹片表面，并固定15min。水洗：用载玻片镊子夹住抹片一端，将固定液弃去倒入染色缸或平皿内，在装有蒸馏水的烧杯中，上下左右摇晃涮洗，夹住松开镊子几次，取出抹片于磁盘边，待干。染色：将固定后的抹片平置于染色架上，用滴管吸取新配制Giemsa染液约2ml，置于要染的载玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上，使染液均匀布满在抹片上。静止染色90min。水洗：用镊子夹住染片，将染片上的染液弃去倒入平皿内，再在装有自来水的烧杯中冲洗，冲洗方法同上。经数次涮洗，直至水洗液无色为止。洗的过程中，若水已变蓝，则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边，待干。将染片在检测仪器中，检测质量，只有满足事先规定质量的口腔拭子核酸的质量才能进行下一步的常温保存，该质量为核酸在口腔拭子中含量为65％以上；第二步，进行口腔拭子核酸的常温保存：稀释液pH总体变化为先下降，后上升，最后趋于稳定。分析其原因为，核酸细胞是不断新陈代谢的，在这一过程中会产生酸性代谢产物，这种酸性代谢产物使得pH下降。因为稀释剂配方中有柠檬酸钠、Tris、碳酸氢钠等缓冲剂，可平衡核酸代谢产物维持核酸生存环境的相对稳定，同样起到保护核酸的作用。分别按口腔拭子核酸与稀释液比例为1∶1、1∶1.5、1∶21∶2.5、1∶3五种比例稀释，测定核酸活力变化，以确定最佳稀释比例。1∶1、1∶1.5，1∶2三种比例的保存效果好，在1∶1，1∶1.5，1∶2三种比例中1∶1，1∶1.5两种比例的保存效果略好，差异不显著(P＞0.05)。1∶2.5，1∶3两种比例的保存效果近似(P＞0.05)，但不如上述三种。综合考虑，选用1∶1.5作为常温保存的稀释液；抗生素的添加是口腔拭子核酸常温保存过程中的重点，抗生素的作用是抑制稀释液中细菌的滋生，为精子细胞提供健康环境。本试验的结果表明，青霉素的效果不如庆大霉素，而青霉素+庆大霉素的混合剂效果最佳，选用这种混合剂；温度是影响口腔拭子核酸常温保存外界因素的代表，早起对于口腔拭子核酸常温保存的适宜温度的研究中，人们认为低温可以抑制核酸的活性，从而达到延长保存时间的目的。而大量的实验研究表明，低温对于口腔拭子核酸细胞的影响很大，会导致口腔拭子核酸细胞的失活，也就谈不上口腔拭子核酸的保存了。最近研究表明，在25度至45度条件下，对于口腔拭子核酸的保存效果最好，其中普遍认可的是30℃室温条件是精液常温保存最好的温度。