[发明专利]一种纯化戊型肝炎病毒的方法

摘要

本发明公开了一种戊型肝炎病毒在体外纯化的方法；该方法通过添加含有甲基纤维素的血清维持细胞生长，利用流行病学调查分离到的HEV毒株接种HepG2细胞，噬斑法挑取病变的细胞，最后用RT‑PCR检测HEV；该发明在HEV体外纯化方面有了大的突破，为进一步研究HEV的生物学及免疫学特性，抗HEV药物筛选与疫苗的研发奠定了良好的基础。

主权项

一种纯化戊型肝炎病毒的方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）将HEV病毒溶液经0.22μm滤膜过滤除菌后，经Real‑time qPCR测定其病毒拷贝数为2×10⁵～2×10⁶拷贝数/mL，加入终浓度为400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素，4℃处理1h，‑80℃保存备用；（2）将HepG2细胞按1×10⁴/孔接种至96孔板中，用含质量百分比10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO₂培养箱中静止培养细胞，直至细胞长成单层；（3）取100μL步骤（1）的HEV病毒悬液利用DMEM培养基依次稀释至10^‑11，按每孔100μL接种至单层细胞中，置37℃孵育2小时，每15min 轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上；弃上清，1×PBS洗涤细胞3次，加入含有质量百分比1‑1.5%甲基纤维素、质量百分比2%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养；（4）待HepG2细胞出现病变时，利用噬斑法挑取发生病变的细胞，溶于150μL DMEM培养基中，取100μL病毒液进行RT‑PCR检测HEV，剩余50μL于‑80℃保存待用；HEV检测引物：外套上游引物(P1): 5′‑AATTATGCYCAGTAYCGRGTTG‑3′ ；外套下游引物 (P2): 5′‑CCCTTRTCYTGCTGMGCATTCTC‑3′；内套上游引物(P3): 5′‑GTWATGCTYTGCATWCATGGCT‑3′；内套下游引物(P4): 5′‑AGCCGACGAAATCAATTCTGTC‑3′；逆转录程序：42℃，60min；72℃，10min；PCR程序：94℃，3 min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，30s；35个循环，总延伸72℃，2 min；（5）将检测为HEV阳性的病毒液对应的50μL接种至长成单层HepG2细胞层的96孔板内；（6）待细胞发生病变后，按步骤（4）挑取病变细胞并检测；（7）按照步骤（4）、步骤（5）重复蚀斑纯化病毒两次；（8）蚀斑纯化三轮后仍为HEV阳性的病毒液检测是否存在肠道病毒的污染。