[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌高效表达猪防御素的方法

摘要

本发明公开一种利用枯草芽孢杆菌高效表达猪防御素的方法，属于基因工程技术领域。方法包括：(1)猪防御素载体的构建及目的蛋白基因的合成；(2)将克隆所得基因和质粒载体pHT43均进行KpnI/BamH Ⅰ双酶切，将双酶切基因片段进行连接和转化，得到重组载体；(3)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌上，筛选得到阳性转化子；(4)将阳性转化子接种于LB培养基，在37℃条件下进行培养，至OD₆₀₀达到0.8时加入诱导剂至浓度为2％，在37℃下诱导反应24h。本发明制备得到了重组猪防御素融合蛋白，猪防御素融合蛋白的表达量高，建立了枯草芽孢杆菌分泌表达抗菌肽的方法，解决了抗菌肽的来源限制等问题。

主权项

1.一种利用枯草芽孢杆菌高效表达猪防御素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取猪防御素BD基因，在BD基因中加入SacB基因和SamyQ基因，得到改造蛋白SS‑BD基因；(2)将步骤(1)所得改造蛋白SS‑BD基因的两端进行KpnI/BamHⅠ双酶切获得SS‑BD目的基因片段；其方法为在改造蛋白SS‑BD基因的5’端加入KpnI酶切位点，在3’端加入BamHⅠ酶切位点，所述SS‑BD目的基因的序列如下：Ggtaccccttttatgattttctatcaaacaaaagaggaaaatagaccagttgcaatccaaacgagagtctaatagaatgaggtcgaaaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagccgtagaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacctgttacagtggcaaggccaagtgctgcatccgctgaggatcc；(3)选用枯草芽孢杆菌质粒载体pHT43进行KpnI/BamHⅠ双酶切，得到pHT43双酶切载体基因片段；(4)将步骤(2)所得物与步骤(3)所得物进行连接和转化，得到重组载体pHT‑BD，将重组载体pHT‑BD转化入枯草芽孢杆菌上，筛选能生长在氯霉素平板上的阳性转化子；所述枯草芽孢杆菌采用B.subtilis ROTA9300为宿主菌；(5)将筛选出的阳性转化子单克隆后接种于LB培养基中，置于摇床，在37℃、180rpm条件下过夜培养，得到一级培养液，将一级培养液按1％的接种量接种于50mL所述LB培养基中，置于摇床，在37℃、225rpm条件下培养，至OD600达到0.8时加入诱导剂至浓度按m/v(质量体积百分比)计为2％，在37℃下诱导反应24h。