[发明专利]一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3’-唾液乳糖的方法

摘要

本发明公开了一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3'‑唾液乳糖的方法，其名称为E.coli‑XYY，它具有3'‑唾液乳糖的合成途径，同时也公开了构建的方法。本发明同时克服了现有的技术难题，获得了一个高效的基因敲除方案；原始菌株在通过基因工程改造以后，除了生产3'‑唾液乳糖外，没有改变菌株的其它特性，不影响发酵生产；该菌株采用的质粒为成熟的大肠杆菌质粒，因此在代谢过程中不影响细菌生长和正常代谢。本发明构建的重组大肠杆菌具有很好的应用前景，为生物法生成3'‑唾液乳糖提供了新的思路。

主权项

1.一种催化乳糖合成3'‑唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：1）分别制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP‑乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N‑乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）的重组质粒，含有β‑半乳糖苷透性酶基因（lacY）的重组质粒，含有唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒； 2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coliBL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌；3）以pKD3为模板，分别扩增带有Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N‑乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N‑乙酰甘露糖胺‑6‑磷酸差向异构酶基因nanE，葡萄糖胺‑6‑磷酸脱氨酶基因nagB，N‑乙酰葡萄糖胺‑6‑磷酸脱乙酰酶基因nagA，Neu5Ac转运子nanT基因，β‑半乳糖苷酶基因lacZ同源臂的抗性敲除片段；4) 先向步骤2所得的携带质粒pSim的宿主菌中转化Neu5Ac醛缩酶基因nanA的抗性敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；6) 以步骤5所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5）的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3）所述的基因全部敲除，获得缺失7个基因的重组大肠杆菌；7) 将步骤6）中基因敲除的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够利用乳糖合成3'‑唾液乳糖的重组大肠杆菌。