[发明专利]一种油茶原生质体的制备和纯化方法

摘要

本发明公开了一种油茶原生质体的制备和纯化方法，属于植物原生质体技术领域。本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法与酶法制备原生质体相比，本发明制备的原生质体不会受酶等化学试剂的伤害，所需时间短，费用低。本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法能够为油茶原生质体的培养、融合和基因转化等原生质体下游实验提供大量材料。

主权项

1.一种油茶原生质体的制备和纯化方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：A制备方法：A1从室外切取油茶一年生枝条，带回水培1‑2天；A2取6片成熟叶，用刀片切去叶片的边缘和叶片主脉，并在叶片每隔0.5‑1cm的位置切上一些缝隙，但不要切断叶片；A3将带有缝隙的叶块浸入蔗糖溶液中进行质壁分离0.5‑1h，期间用镊子将上浮叶块压入蔗糖溶液中；A4取出叶块，用刀片与叶块成45°把叶块切成细长条，越细越好；A5将细叶条转移到盛有叶条洗涤液的容器中，放置30s‑1min；6片叶可以分3‑4批来切条加入到洗涤液中，以材料在洗涤液中不拥挤为限度；A6用镊子将每次洗涤过的叶条取出，放入13％甘露醇CPW溶液中，放置5‑15min；3‑4批细叶条的原生质体依次收集在同一管溶液中；A7用镊子去掉叶条，得到油茶原生质体溶液；B原生质体纯化：B1在油茶原生质体溶液的底层加入蔗糖溶液，原生质体溶液与蔗糖溶液的体积比是1∶1，漂洗原生质体1‑5min；B2转移上层原生质体溶液到离心管中，进行离心，去掉上清液；B3沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，去掉上清液；所述的蔗糖溶液的质量‑体积百分比浓度为18％；B4沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，留下上清液，去掉沉淀；B5上清液经再次离心，去掉上清液，沉淀用200μL质量‑体积百分比浓度为18％蔗糖溶液悬浮原生质体并转移到离心管中；离心的速率为500rpm，时间为12min；B6将原生质体悬浮液加在蔗糖溶液上漂洗1‑5min,取出上层液即为纯化的原生质体溶液；所述的蔗糖溶液的质量‑体积百分比浓度为25％；步骤A3和B1中，蔗糖溶液的质量‑体积百分比浓度为35％；步骤A5中，所述的叶条洗涤液的成分是含有0.03％CaCl₂、 0.1％NaCl和0.075％MgCl₂的35％蔗糖溶液，其中，各种成分的浓度均为质量‑体积百分比浓度，单位为g/ml；步骤A6中，所述的13％甘露醇CPW溶液的成分为：101.0mg/L 硝酸钾，27.2mg/L碳酸二氢钾，1480.0mg/L二水氯化钙，264.0mg/L 七水硫酸镁，0.16mg/L碘化钾，0.025mg/L五水硫酸铜，13％W/V 甘露醇；步骤B2中，离心的速率为1500rpm，时间为8min；步骤B3中，离心的速率为1000rpm，时间为8min；步骤B4中，离心的速率为100rpm，时间为1‑2min。