[发明专利]一种基于等温指数扩增法快速检测miRNA的方法

摘要

本专利公开了一种基于等温指数扩增法快速检测miRNA的方法，涉及荧光探针检测技术领域。通过microRNA与模板DNA特异性结合，在聚合酶和内切酶的作用下实现目标物以指数的形式放大，较传统方法有更高的灵敏度。本方法包括探针预变性‑等温指数扩增反应‑荧光检测三个步骤，反应时间短，能够较好的区分单核苷酸的差异性，此外，等温条件和简单的荧光测量，将大大促进一个简单，快速，低成本的检测系统的发展，有助于我们对microRNA进行定量分析以及生物体的生理病理机制的理解，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。

主权项

一种基于等温指数扩增法快速检测miRNA的方法 ，其特征是包括以下步骤：（1）探针预变性首先，FAM标记的发卡探针1和DABCYL标记的发卡探针2以及模板DNA，在95 ºC下分别孵育5 min；将这三种溶液在室温条件下放置30 min；（2）等温指数扩增反应以下步骤进行的总反应混合液体积为80 µL，不同浓度的microRNA与120 nM 的模板DNA部分序列杂交，加入0.25 mM的dNTPs，在浓度为65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下， 使单链模板DNA进行复制形成双链DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一条短的DNA 引物链，最后加入20.0 nM的发卡探针1和发卡探针2混合于缓冲溶液中，混合溶液在55 ºC反应1 h；缓冲溶液的成分为Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer；（3）荧光检测荧光检测的实验参数如下：激发波长为496 nm，发射波长范围为500‑650 nm。