[发明专利]芽胞@Zr4+

摘要

本发明属于生物材料制备领域，具体涉及芽胞@Zr4+作为功能微球的制备及其在免疫检测中的应用。利用生物化学方法处理芽胞，制备成稳定性高、分散性好的悬浮微球，然后通过Zr4+离子吸附在芽胞表面，并将其应用于免疫检测领域。发明特征在于，收集培养7天的细菌芽孢，经离心洗涤和超声处理，用胰蛋白酶液和去芽孢衣处理液处理，得到除去孢外壁和芽胞衣的表面光滑的细菌芽胞微球，用该微球吸附Zr4+离子制备成芽胞@Zr4+功能微球。本发明的功能微球具有较好的机械强度，粒径均一，比重大小合适，制备工艺简单，成本低，适合高通量检测，对环境友好。本发明还公开了芽孢@Zr4+微球在牛分枝杆菌感染免疫检测中的应用。

主权项

一种利用芽胞杆菌芽孢制备芽胞@Zr4+功能微球的方法，其特征在于下列步骤：(1)芽胞杆菌的培养及芽胞的收集：分别取用50％甘油保存在–20℃的解淀粉芽胞杆菌或巨大芽胞杆菌菌种200μL，加入灭菌的5mL LB液体培养基中，置37℃控温摇床中于180rpm培养过夜，使菌种活化；当OD600＝0.6时，吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，收集培养7天的芽胞，用去离子水洗涤并离心，重复4–5次；(2)芽胞处理：将收集到的解淀粉芽胞杆菌的芽胞、巨大芽胞杆菌的芽胞用双蒸水重悬后，在冰浴条件下，用超声波破碎仪每次超声5min，超声间隔5min使芽胞液冷却，超声输出强度为7‑8，频率为20％‑30％，超声20min后离心洗涤3‑4次；收集沉淀下来的芽胞，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中于80rpm振荡过夜；离心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被剂(Decoating Buffer)，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h；将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，再将芽胞重悬后，取少量用于芽胞计数，剩余的在121℃高压灭活30min，使芽胞失去活性，即为芽胞储备液，置4℃下保存备用；(3)芽胞吸附锆离子：取1mL处理好的芽胞储备液置于EP管中，12000rpm离心2min，弃掉上清，加入1mL 0.5mol/L的Zr4+离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散，将EP管放入摇床中于100rpm振荡1h，离心去上清，用双蒸水洗涤三次，保存在4℃冰箱中备用；其中：步骤(2)中所述的去衣被剂(Decoating Buffer)的配方如下：分别称取0.40g的氢氧化钠，5.84×10‑1g的氯化钠，1.00g的十二烷基硫酸钠，1.54g的二硫代苏糖醇，加超纯水定容至100mL；1％胰蛋白酶溶液的配方如下：称取1g胰蛋白酶，溶于100mLpH7.4的PBS缓冲液中；步骤(3)中所述的0.5mol/L的Zr4+溶液配制方法：称取8.056g的八水氧氯化锆溶于50mL去离子水中。