[发明专利]一种白桦转基因方法

摘要

一种白桦转基因方法，它属于植物基因工程领域。它要解决白桦转基因效率低、脱菌困难和周期长的问题。方法：一、选白桦种子，冲泡后挑选充分吸胀并沉瓶底、萌发结束的成熟种子用于转基因受体；二、消毒；三、制备用于种子受体侵染的工程菌液；四、纵切种子，浸染；五、液体愈伤诱导培养基中进行共培养；六、通过愈伤培养、分化培养、继代培养和生根培养，获得转基因株系，即完成。本发明无需进行白桦外植体的培养，缩短了转基因周期；采用液体共培养方式，除去了重复多次的脱菌步骤，提高了白桦转基因效率；转化效率高，周期短，解决了白桦转基因效率低，脱菌难，转化周期长的问题。白桦转基因株系移栽成活率高，操作简单，易于掌握。

主权项

1.一种白桦转基因方法，其特征在于它按以下步骤实现：一、下午7时，选取发芽率达70％以上的白桦种子装入烧杯中，杯口盖2层纱布并用皮套扎紧，置于水槽中用流水冲40‑45h，然后挑选充分吸胀并沉瓶底、萌发结束的成熟白桦种子用于转基因受体；二、将步骤一中挑选的种子置于无菌培养皿中，在超净工作台中，加入50ml体积浓度为75％的酒精浸泡30s，弃酒精，然后加入50ml质量浓度为30％的双氧水消毒15min，弃双氧水，再用无菌水洗种子3次，置于有无菌水中的平皿中备用；三、在进行步骤二的前一天的21时，取储存于‑80℃的农杆菌工程菌pProBpIAA10::LUC，接种于30ml附加相应抗生素的LB培养液中，在28℃,180rpm/min恒温摇床上过夜培养，第二天上午9时取上述过夜培养物按2％的比例转入新鲜的无抗生素的LB培养液中，继续培养至OD₆₀₀值为0.4‑0.6，获得用于白桦种子受体侵染的工程菌液；四、13时‑15时，在超净工作台中将30个步骤二中消毒的种子依次从正中间纵切，得到白桦种子受体，然后加入200μl步骤三中制备的工程菌液浸泡30s，同时用无菌刀片摘除种皮，获得浸染后的纵切种子；五、将浸染后的纵切种子转接于50ml三角瓶中，每瓶接种30个并加入1.5‑2ml的液体愈伤诱导培养基，置于小摇床上，在23℃‑27℃，50rpm/min条件下避光共培养48h，共培养期间按时更换7次液体愈伤诱导培养基；六、共培养48h后转接至含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基上，在23℃‑27℃，4000‑5000Lux，光照/黑暗为16h/8h条件下进行选择培养，15d后陆续在切口处可见绿色抗性愈伤组织形成，将绿色抗性愈伤组织切下转接到含选择剂、抑菌剂的分化培养基中，15d后陆续产生抗性不定芽，将抗性不定芽转接到含选择剂、抑菌剂的继代培养基中，待抗性不定芽长到1cm时，转接到生根培养基上进行生根培养，10‑14d长出不定根，获得转基因株系，即完成白桦转基因；步骤三中附加相应抗生素的LB培养液：10g/L胰蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+50mg/L利福平+50mg/L潮霉素，pH 7.4；步骤五中液体愈伤诱导培养基：液体WPM+2.0mg/L 6‑BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3；步骤六中含选择剂、抑菌剂的愈伤诱导固体平板培养基：WPM+2.0mg/L 6‑BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3+50mg/L潮霉素+200mg/L头孢霉素；步骤六中含选择剂、抑菌剂的分化培养基：WPM+0.8‑1.0mg/L 6‑BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3+50mg/L潮霉素+200mg/L头孢霉素；步骤六中含选择剂、抑菌剂的继代培养基：WPM+0.8‑1.0mg/L 6‑BA+50mg/L潮霉素+200mg/L头孢霉素；步骤六中生根培养基为：WPM+0.2‑0.4mg/L IBA。