[发明专利]一种在无血清全悬浮培养的MDCK细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒

摘要

本发明公开了一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法及通过该方法获得的禽流感病毒，包括以下步骤：1)制备待接种的MDCK细胞；2)准备毒种：准备鸡胚源禽流感病毒；3)F1代病毒驯化：4)F2代病毒驯化：取F1代中禽流感病毒血凝效价最高的时间点所留取的上清液样本，重复步骤3)；5)F3代病毒驯化：培养F3代病毒的温度为35℃；6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)，得到驯化完成的禽流感病毒；本发明的驯化方法将禽流感病毒从使用鸡胚培养直接驯化到完全适应在无血清悬浮培养的MDCK细胞上高效繁殖，驯化效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定。

主权项

1.一种在无血清全悬浮培养的MDCK细胞生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞：将MDCK细胞装入摇瓶，在转速130rpm，温度37℃、通入浓度为5％的CO₂的条件下，置于培养箱中培养；然后每12h取样一次，进行细胞计数；在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞密度为0.5×10⁶cells/mL，并以此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；2)准备毒种：准备鸡胚源禽流感病毒；3)F1代病毒驯化：按培养基体积的1‰接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入5μg/mL的TPCK‑胰酶进行培养；每12h检测病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h；培养F1代病毒的温度为37℃；4)F2代病毒驯化：取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本；培养F2代病毒的温度为37℃；5)F3代病毒驯化：取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本；培养F3代病毒的温度为35℃；6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)的过程培养F4～F10代，得到驯化完成的禽流感病毒；所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：       剪切力保护剂：嵌段式聚醚F68            500～2500mg/L；抗细胞结团剂：硫酸葡聚糖               20～150mg/L；酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠                 1000～3000mg/L；酸碱度指示剂：酚红                     5～15mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：