[发明专利]一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法

摘要

本发明涉及一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，属于活性肽技术领域。针对目前宽体金线蛭活性肽的制备方法，蛋白水解率较低，活性肽损失较大、操作复杂、不适合工业化大规模生成应用的问题，本发明提供了一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，本发明通过培育枯草杆菌，提取碱性蛋白酶粗提液，通过盐析、等电点沉淀及共溶剂沉淀，静置后分成三相，取中间相酶蛋白沉淀，分离纯化得高活性碱性蛋白酶，再用其酶解宽体金线蛭分离蛋白液，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作简单。

主权项

一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）分别称取4~5g氯化钠，0.1~0.2g磷酸二氢钾，0.01~0.02g七水合硫酸镁，1~2g蛋白胨，5~6g葡萄糖，加入95~100mL去离子水中，以200~300r/min搅拌20~30min，加热至沸腾后，保温20~30min得培养液，按接种量8~10%，将枯草杆菌接种至培养液中，在30~32℃下培养22~24h，量取2~3mL培养液，与1.5~1.6L去离子水混合，分别加入40~42g氯化钠，1.5~1.6g磷酸二氢钾，0.15~0.16g七水合硫酸镁，11~12g牛肉膏，11~12g酵母浸粉，22~24g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.2~10.5，在30~32℃下，以120~130r/min振荡发酵110~120h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心30~40min，取上清液，得粗酶液；（2）称取18~25g硫酸铵置于50~55℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入100~150mL上述粗酶液，加入150~200mL叔丁醇，在22~25℃下，以300~400r/min搅拌20~30min，静置1~2h，置入离心机，在4000~5000r/min离心10~15min，收集中间沉淀相，加入100~120mL pH为7.5~7.9磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液，备用；（3）称取50~80g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入200~320mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在35~37℃恒温水浴中加热1~2h，以8000~9000r/min离心15~20min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至4.5~5.0，转入离心机，以8000~9000r/min离心15~20min，取沉淀，加入去离子水至pH为6.8~7.0，旋转蒸发至原溶液体积的40~50%，得宽体金线蛭分离蛋白液；（4）向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入50~60mL上述步骤（2）制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在50~55℃下，酶解3~4h，置于沸水浴中灭酶10~15min，冷却后置于5000~6000r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥2~3h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。